Summary

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

Published: June 11, 2019
doi:

Summary

Bu protokol, 18 gün içinde insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSCs) hepatosit benzeri hücreleri verimli bir şekilde üretmek için bir monolayer, serum içermeyen bir yöntem ayrıntıları. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut ve karaciğer tomurcuk ataları hepatosit benzeri hücreler oluşturmadan önce gibi ara hücre türlerine ayırt olarak altı adım gerektirir.

Abstract

Karaciğer zararlı maddeleri detoxifies, hayati proteinleri salgıları ve önemli metabolik faaliyetleri yürütür, böylece yaşam sürdürüyor. Sonuç olarak, karaciğer yetmezliği-kronik alkol alımı, Hepatit, akut zehirlenme veya diğer hakaret neden olabilir-kanama, sarılık, koma ve sonunda ölüm sonuçlanabilir ciddi bir durumdur. Ancak, karaciğer yetmezliği tedavisinde yaklaşımlar, yanı sıra karaciğer fonksiyon ve hastalığın çalışmaları, insan karaciğer hücrelerinin bol tedarik eksikliği kısmen stymied olmuştur. Bu amaçla, bu protokol insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSCs), karaciğer kaderi altı ardışık farklılaşma adımları boyunca nasıl belirtildiğini açıklayan bir gelişimsel yol haritası tarafından yönlendirilen hepatosit benzeri hücrelere verimli farklılaşma ayrıntıları. Karaciğer farklılaşma teşvik ve açıkça istenmeyen hücre kaderlerinin oluşumunu bastırmak için gelişimsel sinyal yolları manipüle ederek, bu yöntem verimli insan karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin nüfusu üretir gün 6 ve 18 PSC farklılaşma, sırasıyla. Bu, küçük moleküller ve büyüme faktörleri tarafından serum içermeyen bir kültür ortamında uygulanan, gelişimsel sinyalizasyon yollarının geçici olarak hassas kontrolü yoluyla elde edilir. Bu sistemde farklılaşma monolayers oluşur ve karakteristik hepatosit enzimleri ifade ve kronik karaciğer yetmezliği bir fare modeli erit yeteneğine sahip hepatosit benzeri hücreler verir. Verimli bir şekilde insan karaciğer hücrelerinin çok sayıda üretmek için yetenek karaciğer yetmezliği tedavisi için etkileri vardır, ilaç taraması için, ve karaciğer hastalığının mekanik çalışmalar için.

Introduction

Bu protokol amacı verimli insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmektir (hpscs) karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin zenginleştirilmiş nüfus2. İnsan karaciğer ataları ve hepatosit benzeri hücreler hazır bir tedarik erişim karaciğer fonksiyon ve hastalık araştırmak için çabaları hızlandıracak ve karaciğer yetmezliği için yeni hücresel transplantasyon terapileri olanaklı hale gelebilir3,4, 5‘ i yapın. Bu hPSCs beri geçmişte zorlu kanıtlanmış (hangi embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreleri dahil) insan vücudunun tüm hücre türlerine ayırt edebilirsiniz; Sonuç olarak, onları sadece tek bir hücre tipi saf bir nüfus içine ayırt etmek zor olmuştur, karaciğer hücreleri gibi6.

HPSCs ‘i karaciğer hücrelerine tam olarak ayırt etmek için, ilk olarak karaciğer hücrelerinin sadece nasıl belirlenmesini değil, karaciğer hücresi türlerinin nasıl geliştiği de anlaşılması önemlidir. Nasıl non-karaciğer hücrelerinin geliştirmek bilgi mantıksal olarak farklılaşma sırasında karaciğer olmayan sırların oluşumunu bastırmak için önemlidir, böylece sadece bir karaciğer kader2doğru hpscs rehberlik. İkincisi, hPSCs bir karaciğer kaderi ayırt hangi aracılığıyla birden fazla gelişimsel adımları tanımlamak için esastır. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi (APS), kesin endoderm (de), posterior foregut (PFG) ve karaciğer tomurcuk ataları (lb) olarak bilinen birden çok hücre türleri farklılaştırarak hepatosit benzeri hücreler (hep) şekillendirmeden önce bilinmektedir. Önceki çalışma, karaciğer kaderi ve diğer non-karaciğer hücre türleri (mide, pankreatik ve bağırsak progenitors dahil) oluşumunu bastırdı sinyalleri belirterek sinyalleri ortaya her gelişimsel soy seçim2, 7 , 8‘ den itibaren.

Toplu olarak, bu Öngörüler ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut, karaciğer tomurcuk ataları ve son olarak, hepatosit benzeri hücreler2hpscs ayırt etmek için bir serum-ücretsiz, tek tabakalı yöntemi yükselmişti. Genel yöntem, uygun bir yoğunlukta bir tek tabakalı hpscs tohumlama içerir, farklılaşma medya altı kokteyl hazırlanıyor (büyüme faktörleri ve çeşitli gelişimsel sinyalizasyon yollarını düzenleyen küçük molekülleri içeren), ve ardışık olarak 18 gün boyunca farklılaşma neden bu medyayı ekleyerek. Süreç boyunca, hücrelerin hiçbir geçiş gereklidir. Not, çünkü bu yöntem açıkça olmayan karaciğer hücre türleri oluşumunu bastırmak sinyalleri içerir, bu farklılaşma yaklaşımı1 daha verimli karaciğer ataları ve hepatosit gibi hücreler genişletici karşılaştırıldığında üretir farklılaşma yöntemleri2,9,10,11,12. Ayrıca, bu metinde açıklanan protokol, hepatik transkripsiyon faktörleri ve enzimlerin diğer protokoller tarafından üretilenden daha yüksek seviyelerde olduğunu ifade eden hepatositlerin daha hızlı oluşumunu sağlar9,10 , 11 ‘ i , 12‘ ye kadar.

Burada açıklanan protokol mevcut farklılaşma protokolleri üzerinde bazı avantajları vardır. İlk olarak, üç boyutlu farklılaşma yöntemleri ile karşılaştırıldığında Teknik olarak daha basit olan hpscs Tek tabakalı farklılaşma gerektirir, gibi embriyoid organları güvenenler gibi13. İkinci olarak, bu yöntem son bir avans bu nedenle kesin endoderm hücreleri (karaciğer hücrelerine erken bir ön) verimli ve hızlı bir şekilde 2 gün içinde HPSC farklılaşma2,7içinde oluşturulan olabilir, böylece sonraki etkinleştirme artan saflık ile hepatosit üretimi. Üçüncü olarak, yan yana karşılaştırmalar, bu yöntem tarafından üretilen hepatosit benzeri hücreler2 daha fazla albumin üretmek ve hepatik transkripsiyon faktörleri ve enzimlerin diğer yöntemlerle üretilen hepatositlere kıyasla daha yüksek düzeyde ifade10, 11,12.

Protocol

1. farklılaşma ortamının hazırlanması Not: Kullanılan malzemeler ve reaktifler ile ilgili üretici bilgileri için malzeme tablosuna bakın. Baz kimyasal olarak tanımlanan medyanın hazırlanması (CDM)Not: CDM2, CDM3, CDM4 ve CDM5 çeşitli aşamalarında karaciğer hücreleri Için hPSCs ayırt etmek için temel Medias kullanılan kimyasal olarak tanımlanır ortam. Bu Medias bileşimi Tablo 1′ de bulu…

Representative Results

APS farklılaşma 24 h sonra, koloniler genellikle hPSC kolonileri circumscribes parlak sınır kaybı ile uyumlu farklılaşmış koloniler daha farklı bir morfoloji benimsemeye olacaktır. Morfolojik, ilkel çizgi hücreleri genellikle düzensiz sınırları var ve daha Spread ve hPSCs daha az kompakt-bu pluripotent epiblast hücreleri ayırt ve ilkel içine giriþ olarak epitelyal-mesenkimal geçiş uyarılıdır çizgi in vivo. Farklılaşma öncesinde hPSCs kolonisi boyutu çok büy…

Discussion

Bu yöntem, karaciğer tomurcuk progenitors zenginleştirilmiş nüfus üretimi sağlar ve daha sonra hepatosit benzeri hücreler, hPSCs dan. İnsan karaciğer hücrelerinin zenginleştirilmiş nüfus oluşturmak için yeteneği bu tür hücrelerin pratik kullanımı için önemlidir. Önceki yöntemler hPSCs gelen hepatositler üretmek için karaciğer ve non-karaciğer hücreleri hem de içeren ezik hücre nüfus sağladı, kemirgenler içine transplantasyon üzerine, karaciğer dokusu ek olarak kemik ve kıkırdak ver…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz tartışmalar için Bing Lim için teşekkür ederiz ve Stanford kök hücre Biyoloji Enstitüsü & rejeneratif tıp altyapı desteği için. Bu çalışma California Enstitüsü rejeneratif tıp (DISC2-10679) ve Stanford-UC Berkeley Siebel kök hücre Enstitüsü (L.T.A. ve K.M.L.) ve Stanford Beckman merkezi moleküler ve genetik tıp yanı sıra Anonymous tarafından desteklenmektedir Baxter ve DiGenova aileleri (K.M.L.).

Materials

 Geltrex Thermofisher Scientific A1569601
1:1 DMEM/F12 Gibco 11320033
0.2 μm pore membrane filter Millipore GTTP02500
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850
Thiazovivin Tocris Bioscience 3845
 Accutase Gibco or Millipore  Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement Thermofisher Scientific 31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement Thermofisher Scientific 31765035
KOSR, Knockout serum replacement Thermofisher Scientific 10828028
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich   P8136
Transferrin  Sigma-Aldrich   10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermofisher Scientific 11905031
human Activin R&D 338-AC
CHIR99201 Tocris 4423
PI103 Tocris 2930/1
human FGF2 R&D 233-FB
DM3189 Tocris 6053/10
A83-01 Tocris 2939/10
Human BMP4 R&D 314-BP
C59 Tocris 5148
TTNPB Tocris 0761/10
Forskolin Tocris 1099/10
Oncostatin M R&D 295-OM
Dexamethasone Tocris 1126
Ro4929097 Selleck Chem S1575
AA2P Cayman chemicals 16457
human recombinant Insulin Sigma-Aldrich   11061-68-0

References

  1. Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
  2. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  3. Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
  4. Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
  5. Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
  6. Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
  9. Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
  10. Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
  11. Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
  12. Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
  13. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  14. Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
  15. Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).

Play Video

Cite This Article
Loh, K. M., Palaria, A., Ang, L. T. Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells. J. Vis. Exp. (148), e58975, doi:10.3791/58975 (2019).

View Video