Multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez kütle spektrometresi kullanılarak yüksek üretilen iş ve kapsamlı uyuşturucu gözetim

Summary

Burada biz bir yüksek-den geçerek yöntemi ile kalite kontrol multisegment enjeksiyon-kılcal göre geliştirilmiş çözünürlük ve ilaç kötüye kullanımı ve bunların metabolitleri büyük paneller tespiti için sağlar kapsamlı uyuşturucu gözetimi için tarif Elektroforez-kütle spektrometresi.

Abstract

Yeni analitik yöntemleri uyuşturucu tarama, yüksek üretilen iş, henüz kapsamlı bir endişe verici opioid ve reçeteli ilaç krizi halk sağlığı verilen etkinleştirmek için acilen ihtiyaç vardır. Bir iki-bağlayıcılı immunoassay ekranda dayalı geleneksel idrar uyuşturucu testi Gaz Kromatografi-tandem kütle spektrometresi (GC-MS/MS) tarafından takip veya sıvı Kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yöntem pahalı ve önyargı eğilimli olurken kötüye (DoA) bilinen ilaçların hedeflenen panelleri ile sınırlıdır. Burada, çözünürlük ve DoA ve onların metabolitleri genişletilmiş bir panel tespiti için multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi (MSI-CE-MS) kullanırken sağlar uyuşturucu gözetimi için geliştirilmiş bir yöntem anahat. Multiplexed ayrımları on idrar örnekleri CE (< 3 dk/örnek) tarafından bir kalite kontrol ile birlikte bir saat-in-Kütle Spektrometre (TOF-MS) pozitif iyon modu algılaması altında bırakmak için kimlik uçuş kullanarak tam inceden inceye gözden geçirmek veri toplama ile ve DoA miktar yukarıda Önerilen kesme düzeyleri. MSI-CE-Bayan örnek kesimi arasında bir electrokinetic rondela ile doğru yerde kullanırken uyuşturucu İzomerler ve Isobarlar, arka plan etkileşimler de dahil olmak üzere mükemmel bir çözünürlük elde edilir kütle/moleküler formülü ile birlikte comigration bir eşleşen deuterated iç standart ve algılama bir veya daha fazla biyolojik dönüştürülmüş metabolitleri DoA kimlik daha geniş bir algılama pencere üzerinde kolaylaştırmak. Ayrıca, İdrar numuneleri doğrudan doğruya ezelî enzim deconjugation karmaşık örnek testleri olmadan hızlı tarama için analiz edilebilir. MSI-CE-MS tedavisi reçete ilaç bağlılık onaylayan, yasadışı uyuşturucu kullanımı/ikame açığa ve en uygun doz rejimler değerlendirilmesi gibi yüksek riskli hastaların izlenmesi için gerekli olan DoA geniş bir yelpazede gözetim sağlar hassas tıpta yeni gelişmeler için gerektiği gibi.

Introduction

Suistimal ve kronik ağrı yönetimi için opioid bağımlılığı endişe verici bir artış ile 70.000 uyuşturucu aşırı doz ölümlerini 2017¹' tahmini ABD halk sağlığı için büyüyen bir tehdit temsil eder. Benzer şekilde, çeşitli diğer psikotropik ilaçlar da yaygın çocuklar ve genç yetişkinler için anksiyete, depresyon ve ruh sağlığı sorunları²tedavisi için reçete edilir. Sonuç olarak, idrar uyuşturucu testi yöntemleri, geniş çalışma alanı ve adli toksikoloji, için geliştirilmiş dayanıklılık ve bağımlılık^3,4' e yatkındır reçete ilaçlar tedavi edici izlenmesi için hayati önem taşımaktadır. Bu bağlılık, en uygun terapötik etkinlik ve hasta güvenliği, yasadışı veya nonprescribed ilaç kötüye kullanımı da dahil olmak üzere potansiyel ikame açığa emin olmak için gereklidir. Şu anda, iki katmanlı bir yaklaşım, idrar uyuşturucu testleri DoA için itimat bir ilk rekabetçi immunoassay ekran üzerinden oluşan bakım noktası aygıtları veya laboratuvar cihazları, ardından bir doğrulama testi ile GC-MS/MS göre daha fazla özgüllük ile ve giderek, LC-MS/MS⁵. Ancak, uzun Antikor Reaktif nonspecifically çeşitli ilaç sınıfları için bir güvenilir kimlik ve miktar belirli uyuşturucu veya karmaşık uyuşturucu engeller meşru bir ekran-pozitif sonuç elde bağlamak gibi önyargı için eğilimli olduğunu karışımlar⁶. Bu bağlamda daha doğru idrar uyuşturucu testleri kapsamlı çoklu ekranlar, tasarımcı ilaçlar da dahil olmak üzere⁷ fahiş maliyetleri göz önüne alındığında acilen ihtiyaç vardır ve geleneksel kurtulmak sentetik idrar ürünleri deneyleri hedef.

Yüksek verimli ayrımları birlikte ile yüksek çözünürlüklü MS (TOF veya orbitrap kitle Analizörleri kullanarak HRMS) flizofreni ve DoA^{8,9 paneller genişleyen bir dönemde uyuşturucu gözetimi için nontargeted bir strateji olarak önerilmiştir} . Ancak, geleneksel LC ayırmaları yavaş (> 15 dk) nedeniyle uzun elüsyon kez çözümlemesi için kimyasal olarak farklı sınıfların DoA ve rutin uyuşturucu tarama için örnek çıkışını sınırlar degrade elüsyon programlar kullanarak onların metabolitleri vardır. Alternatif olarak, doğrudan analiz yöntemleri desorpsiyon iyonlaşma (DESI)¹⁰ tabanlı ve lazer diyot termal desorpsiyon (LDTD) izin olmadan ayrılık¹¹eleme daha hızlı uyuşturucu için. Ancak, bu ortam iyonlaşma yöntemler böylece bağımsız doğrulama test gerektiren karmaşık idrar örnekleri analiz ederken izobarik/isomeric etkileşimler yatkındır.

Bizim laboratuvar son zamanlarda MSI-CE-Bayan¹²tarihinde dayalı bir yüksek verimli ayrılık çözünürlük ve veri kalitesini koruyarak örnek iş çıkarma yeteneğini artırmak için bir çoğaltılmış ayrılık platform geliştirmiştir. Kalite kontrol (QC) büyük ölçekli nüfus için gerektiği gibi toplu düzeltme için izin vermek, ancak yeni veri iş akışları MSI-CE-MS (örneğin, metabolomics) birim tarafından kısıtlanmış biospecimens profil oluşturma nontargeted metaboliti için dizayn edilebilir çalışmalar¹³. Bu durumda, renk ayrımları ile çözünen iyonlaşma 10 veya daha fazla örnekleri içinde tek bir seri enjeksiyonu için sağlar bir geleneksel kılıf sıvı arayüzünü kullanırken kararlı durum solvent koşullarda meydana gelen bir isocratic arabellek kullanarak gerçekleştirilir DoA ve onların metabolitleri¹⁴farklı sınıflar hızlı henüz seçici tarama için çalıştırın. Daha fazla depresyona hastaların enzim hidroliz¹⁵engeller bir "seyreltik-ve-ateş" yöntemiyle temsilcisi bir kohort otantik idrar örnekleri doğrudan analizi için MSI-CE-Bayan doğrulamak için bu çalışmanın odak noktasıdır. Ayrıca, seri örnek fişler MSI-CE-Bayan¹⁶ arasında electrokinetic bir spacer uygulanması daha fazla çeşitli uyuşturucu İzomerler/Isobarlar çözünürlüğünü artırmak, idrar etkileşimler, arka plan için gerçekleştirilen ve/veya çapraz-etkileşimler DoA büyük panelleri tarama zaman. DoA mutlak miktar eşleştirme kullanarak kendi standartlarına deuterated zaman idrar örnekleri içinde (d-mi) MSI-CE-Bayan kullanırken gösterdi. Bu yaklaşım aynı zamanda uyuşturucu kimlik gibi bir uyuşturucu paneli karisimin önerilen karşılaştırıldığında ekran-pozitif durumlar doğru örnek konumunu deducing kolaylaştırır, ayrıca bir iç başvuru/QC içinde işlevi cut-off düzeyi Eleme aynı çalışma.

Protocol

Kör İdrar numuneleri lütfen Dr Zainab Samaan olan çalışma Hamilton entegre araştırma Etik Kurulu tarafından kabul edildi St. Joseph's Hospital (Hamilton, ON, Kanada), ruh bozukluğu klinikte üzerinden tarafından temin edilmiştir.

1. reaktifler ve örnek çözümler hazırlık

1. Arka plan elektrolit hazırlık
   1. Arka plan elektrolit (BGE) iki haftada bir, 1 M formik asit, pH 1.8, % 15 v/v Asetonitril organik deðiþtiricisi olarak ile 50 mL hazırlayın.
   2. Aliquot 1,9 mL formik asit stok (26.5 M) 50 mL volumetric flask konsantre ve 7,5 mL Asetonitril ve 40,6 mL deiyonize su 50 mL Toplam hacim getirmek ekleyin. O zaman, çözüm 15dk için solüsyon içeren temizleyicide ve sıkı sızdırmazlık steril bir şişeyle aktarmak.
2. Kılıf sıvı hazırlık
   1. 200 mL %0,1 formik asit 60:40 (MeOH:H₂O) oluşan kılıf sıvı çözeltisi haftalık, hazır olun.
   2. Aliquot 200 µL formik asit (26.5 M hisse senedi) 120 mL MeOH ve 80 mL sıvı kılıf ve 15 dakikadır degas yapmak için H₂O içeren bir şişe içine.
   3. Sonra aşağıdaki başvuru iyonları, pürin ve hexakis 10 µL ekleyin (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), msabit kitle sinyalleri sağlamak için kılıf sıvı içine /z 121.05087 ve m/z 922.00979, anılan sıraya göre.
      Not: Bu başvuru iyonları gerçek zamanlı toplu düzeltme için izin ve aynı zamanda potansiyel matris indüklenen iyon bastırma veya geliştirme etkileri için ayırma sırasında izleyebilirsiniz.
3. Standart hazırlama
   1. 3 klinik tarama kesme x 84-uyuşturucu paneli karisimin seviye (L6)¹⁴ 1 ml metanol, kimyasal bir tedarikçiden satın ilaç standartları kullanarak içeren bir standart çözüm hazırlamak. Ayrı ayrı 10 kat daha yüksek konsantrasyon daha 84-ilaç karışımı 1 ml metanol'deuterated iç uyuşturucu standartlarla (d-ISS) eşleşen 48 karışımı hazırlayın. Ayrıca, 4 200 µM içeren bir hisse senedi çözüm hazırlamak-fluoro -L-fenilalanin (F-Phe) ve 3-kloro -L-tirozin (Cl-Tyr) 1 ml deiyonize H₂O.
   2. 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µL) ve 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µL) toplam yapmak için bir Sertifikalı sentetik idrar matris (40 µL) on kat seyreltme yanı sıra yukarıda belirtilen 84-ilaç karışımı (20 µL) ve 48 d-ISS (20 µL), beş kat seyreltme gerçekleştirmek 100 µL 250 µL santrifüj tüpü hacmi.
4. Dış kalibrasyon eğrisi hazırlık
   1. Beş maddelik dış kalibrasyon eğrileri (aşağıda açıklandığı gibi) quadruplicate içinde hazırlamak (n = 4) 84-uyuşturucu standart karışımı ve onların karşılık gelen d-ISS 1.3.1. adımda yapılan 48 kullanarak bir 20-fold dinamik aralığı boyunca. Örneğin, beş maddelik dış kalibrasyon eğrisi yapmak için 2 - 4, 10-, 20-, 84-ilaç karışımı (L6, adım 1.3.1) sulandrarak sağlamak ve 40-fold, d-ISS (20 µL) ve 4-F-Phe (on kat bir seyreltme eşleşen bir beş kat seyreltme hazırlamak gerekli ise 10 µL) ve Cl-Tyr (10 µL) ek bir 100 µL toplam hacmi yapmak sentetik idrar dizey içinde olduğu gibi. Eşleşen bir d-IS belirli bir ilaç için kullanılamadığı zamanlarda kullanmak 4-F-Phe bir vekil olarak veri normalleştirme için durumda.
      Not: çapraz müdahale ek d-ISS dahil önlemek (izobarik) onlar tarafından CE ayrımı tamamen çözümlenmezse paneli içindeki diğer DoA ile.
5. İdrar numune hazırlama
   1. Deidentified sabah idrar örnekleri bilinen reçeteli ilaç geçmiş on depresyona hastalarının temsilcisi bir kohort çözülme. Analiz için çözdürülen kadar toplandıktan sonra İdrar numuneleri-80 ° C'de depolayın.
      Not: birden çok donma-çözülme çevrimleri idrar veya gecikmiş bir depolama oda sıcaklığında bazı DoA metabolitleri ve onların conjugates kimyasal istikrar üzerindeki etkileri nedeniyle topluluğu takip kaçının.
   2. Girdap deidentified sabah idrar örnekleri için 30 s ve sonra onları 14.000 x g sedimantasyon için de 1 dk santrifüj kapasitesi. Bundan sonra yukarıda bahsedilen, aliquot 10 µL işlenen idrar, d 10 µL-olduğunu ve F-Phe/Cl-Tyr ve 25 µL deiyonize H₂O ve 1 dk. için girdap 5 µL (teknik hassas değerlendirmek için nüsha olarak bu adımları yineleyin). Yukarıda açıklanan karışımdan 20 µL aliquot analiz için polipropilen bir şişe aktarın.

2. CE-TOF-MS sistem kurulumu

1. Kaplamasız erimiş silis kılcal parametreleri Merkezi Klima
   1. Polimid kaplı bir kaplamasız açık borulu erimiş silis kılcal 50 mikron, 360 µm, bir dış çapı bir iç çapı ile kullanarak tüm standartları, dış kalibrasyon eğrileri ve 1.3-1.5 bölümlerde hazırlanan İdrar numuneleri ayrılmış emin olun ve bir Toplam 135 cm kılcal damar uzunluğu.
      Not: Bir elmas kesici aletleri tutarlı kılcal fışkırma ve düzgün kesme emin olmak için daha fazla kontrol sağlamak için kullanılır.
   2. Yaklaşık 7 mm örnek etkilenmişimdir azaltmak için ve potansiyel polimid organik çözücü ne zaman temas şişme önlemek için bir kılcal pencere maker ile her iki distal kapiller uçtan, polimid kaplamanın kaldırın.
   3. 2 mm kapiller çıkış CE püskürtücü iğne dışarı çıkıntı ve kılcal damar giriş iki 360 ° döner döngü tarafından CE kartuşta yüklediğinizden emin olun. Sonra dikkatli CE CE kartuşu takın ve CE püskürtücü İyon kaynağı dışında kılcal Klima yer.
      Not: Kesim sürekli olarak kapiller çıkış istikrarlı electrospray MS birleştiğinde geçerli sağlamak için çok önemlidir. Bu çalışmada kullanılan iki farklı püskürtme: CE püskürtücü örnek analiz için kullanılan ve bir LC püskürtücü kitle kalibrasyon için kullanıldı.
   4. İyon kaynağı yerleştirilmedi CE püskürtücü ile Merkezi Klima kılcal yerine getirdiğinizden emin olun. LC püskürtücü iyon kaynağında koymak.
      Not: Bu herhangi bir kirlenme TOF-MS için daha sonra birleştiğinde koaksiyel kılıf sıvı arabiriminin kaçınırken kitle kalibrasyon için sağlar.
   5. Yeni kılcal floş işlevi (940 mbar) seçerek araç kontrol ve Temizleme süresi 30 dk her aşağıdaki sırada dört farklı çözücüler için ayarlamak için kullanılan satıcının yazılım durumu: deiyonize metanol, 1 M NaOH, su ve BGE. İsocratic pompa bekleme kapiller Klima döneminde koymak emin olun.
   6. CE-MS püskürtücü herhangi bir kalıntı tuz yatakları kaldırmak için MeOH/H₂O batırılmış bir doku bezle silin.
   7. Günlük önleyici bakım CE-MS sisteminin örnekleri analiz daha önce yapın. Metanol CE elektrot (giriş), ama bir isopropanol kullanın silip, su ve tuz birikmesini önlemek için potansiyel örnek etkilenmişimdir sınırlamak önemlidir CE-Bayan arayüzey temizlemek için (50: 50) karışımı kullanın.
   8. LC püskürtücü İyon kaynağı dışarı çıkarmak ve temizlenmiş püskürtücü ile yeni şartına kılcal koaksiyel kılıf sıvı arabiriminde CE-MS için pozisyon.
   9. İsocratic pompa açmak ve geçerli bir gerilim 30 kV 15dk için istikrarlı bir CE geçerli profil önce idrar analizi elde emin olmak için.
2. CE kullanarak ekleme ve ayırma koşulları
   1. CE parametrelerini ayarlamak ve adım Önkoşullanmaseçmek için araç kontrol etmek için kullanılan satıcı yazılımını açın. 600 için ayarla işlevini sifonu s ve BGE şişe konumunu belirtin.
      Not: Bir harici su chiller bu birim tarafından kısıtlanmış örneklerinin büyük toplu işlemleri analiz ederken örnek buharlaşma önlemek için gerektiği şekilde örnek tepsi özellikleri, soğutma eksikliği CE sistemlere bağlı olması gerekebilir.
   2. Hydrodynamically örnekleri için 5 100 mbar adlı enjekte için enjeksiyon işlev küme s ve electrokinetically enjekte BGE çubukları 30 kV 75 s.
      Not: Bu işlem otomatik olarak toplam 11 ayrı örnekleri analiz yazılımı bir yöntem program içinde gerçekleştirilen bir BGE spacer (aynı konumdan flakon) ardından her örnek enjeksiyon (bir konumdan farklı flakon) ile tekrarlanır aynı bir MSI biçimi kullanarak çalıştırın. 10 İdrar numuneleri analiz tarama kesme 84 panelli uyuşturucu karisimin sonra rasgele sırada düzeyi her MSI-CE-MS çalışması için belgili tanımlık ilk örnek durum olarak enjekte edilir.
   3. 30 yaşında olmak uygulanan gerilim ayarla 40 dk. zaman çizelgesi kullanarak olmak kV, kartuş sıcaklık 25 ° C ve Toplam çalışma zamanı olmak için 40 dk 0 dk basınç gradyan 2 mbar/dk ayırma sırasında uygulamak.
      Not: Bazı zayıf, temel benzodiazepinler içerir yavaş geçiş uyuşturucu ve tarafsız/asitli ilaçlar (örneğin, asetaminofen, barbitüratlar) elüsyon için izin vermek için ayırma sırasında bir degrade basınç uygulanır. Ancak, en temel DoA ve onların metabolitleri katyonlar amfetaminler, opioidler ve alkoloidler diğer sınıflar da dahil olmak üzere 25 dk içinde olarak göç ederler.
   4. Örnek alma tamamlandıktan sonra ertesi güne kadar BGE ile düşük basınç (50 mbar), kılcal durulayın emin olun. Aksi takdirde, kılcal 600 için durulama yüksek basınç (900 mbar) su ile ve sonra 600 s s, havaya sahip ve kadar sonraki kullanmak bir püskürtücü tutucu içinde saklayın.
3. Isocratic pompa ve kılıf sıvı
   1. Bir sonsuzluk Isocratic pompa ve bir sonsuzluk Degasser CE-MS püskürtücü 10 µL/dk hızında kılıf sıvı (% 0,1 v/v formik asit ile 60:40 MeOH:H₂O) sunmak için kullanın.
4. TOF-MS ayarları
   1. TOF-MS, bir koaksiyel kılıf-sıvı electrospray İyon kaynağı ve ısıtmalı azot gazı, CE ünitesi ile donatılmış emin olun.
   2. TOF-MS mbir kitle yayılmış pozitif iyon algılama altında faaliyet /z 50-1.700, veri toplama hızı ile 500 ms/spektrum. Bu profil ve bir ".ler" dosya biçiminde saklanan verileri centroid olun.
   3. Olmak electrospray iyonlaşma koşulları ayarlama: 2.000 V Vcap ve meme gerilim, 10 PSI, Nebulizatör gaz ve kurutma gaz teslim 8 L/dk 3.5 L/min 195 ° C'de bir kılıf gaz akışı ile 300 ° c Buna ek olarak, fragmentor, kepçe ve Oct1 RF MS voltaj ayarlarını 120, 65 ve 750 V, anılan sıraya göre ayarlayın.
      Not: Vcap ve meme gerilim yanı sıra Nebulizatör gaz MSI-CE-MS içinde kullanılan seri örnek enjeksiyon sırası sırasında kapatılmış ama electrospray 1 dk geçerli önlemek için elektroforetik ayrımı inisiyasyon sonra geri çevrilmek üzere programlanmış oldu hataları nedeniyle etkileri emme.
   4. Satıcının yazılım (Tablo reçetesi) kullanarak araç Denetim ve veri toplama gerçekleştirmek.
5. Veri analizi
   1. İşleme, düzeltme, veri ve temsilcisi DoA için ayıklanan iyon electropherograms (EIEs) entegrasyon ve onların metabolitleri dahil olmak üzere satıcının yazılım kullanarak MSI-CE-MS veri analiz.
   2. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
      1. Chromatogramsaltında ayıklama veri biçimive Kromatografik ve kütle spektral verileri biçimlendirmek için profil modu seçin.
      2. İkinci dereceden/kübik Çetinkaya deniyordun düzeltme işlevi ve işlev genişliği 15 puan altında seçin.
      3. Ardından Entegre (MS), Çevikolmak Integrator ayarla ve en yüksek tepe filtrelerialtında en büyük 11 doruklarına sınırının seçin.
      4. Görüntüle' yi tıklatın, entegrasyon tepe listesinitıklatın ve en sayısı, tutma zamanı (RT), en yüksek alan, en yüksek yükseklikve sinyal-gürültü oranı (SNR) seçin.
      5. Bu parametreler bir benzersiz bir yöntem adı altında kaydedin. Bu yöntemi uygulamak için işlem ve her veri kümesi yorumlamak.
         Not: Bir Özet Tablo ile en yüksek sayı, RT, en yüksek alan ve yükseklik ve SNR sağ tarafında görüntülenir. Ölçülen RT ve her DoA ya bir eşleştirme için entegre pik alanı d için veri normalleştirme gerçekleştirmek-olduğunu veya (e¤er varsa) analitik hassas geliştirmek için F-Phe için.

3. İdrar numuneleri ve dış kalibrasyon eğrileri analizi

1. MSI-CE-MS içinde kullanılan farklı seri enjeksiyon yapılandırmaları
   1. Beş enjeksiyonları 84 ilaç standartları d ile karışımı performansı tekrar uyuşturucu izomer/isobar çözünürlük (şekil 1A), göstermek için kullanılan ilk seri örnek enjeksiyon yapılandırma için emin olun-olduğunu ve 4-F-Phe/Cl-Tyr, altıncıyı tarafından takip enjeksiyon, sentetik idrarda boş bir örnek olan ve beş ek enjeksiyonları standart ilaç karışımı.
   2. Hastaların bilinen reçete (şekil 2A), DoA algılama bireysel idrar örneklerinde göstermek için kullanılan ikinci seri örnek enjeksiyon yapılandırması için ilk örnek tak 84-uyuşturucu standart karisimin karışımı olduğundan emin olun bir 1 x kesme filtreleme düzeyi (pozitif kontrol) ardından 10 seyreltilmiş İdrar numuneleri randomize bir iğne ile hastaların: #293, 88 #, #309, 43 #, #281, #64, #221, #208, #183 ve #50.
   3. Calibrant çözümleri DoA için 0.25 için karşılık gelen bir 20-fold doğrusal dinamik aralığı boyunca hazır dış kalibrasyon eğrileri tek vadede edinimi göstermek için kullanılan üçüncü seri örnek enjeksiyon yapılandırması için sağlamak x, 0.5 x, 1 x 2.5 x, ve 5 x kesme konsantrasyon düzeyleri, birlikte olduğu bir sentetik idrar matris ek gibi d-IS ve F-Phe/Cl-Tyr eşleştirme (n = 4).

Representative Results

MSI-CE-Bayan sağlar on veya daha fazla ayrı örnekleri üretilen iş büyük ölçüde artırır tek çalışması içinde seri enjeksiyon (< 3 dk/örnek) karmaşık enstrümantal değişiklikler, sütun değiştirme programları veya pahalı altyapı olmadan yatırımlar (şekil 1A). Alternatif bir dizi örnek hidrodinamik enjeksiyonları ve BGE electrokinetic spacer iyonlar ısısını elektroforetik ayrımı (pH kesinlikle asidik elektrolit koşullarda gerçekleştiği bir değiştirilmemiş erimiş silis kılcal damar içinde gerçekleştirilir 1.8). çözünen iyonlaşma da kararlı durum koşullar altında oluşur. Bu durumda bir kitle calibrant ile bir koaksiyel kılıf sıvı altında pozitif iyon modu algılaması gibi kitle calibrant iyonları sinyal tarafından izlenen en az iyon bastırma veya geliştirme etkileri ile CE-MS için arayüz olarak kullanılır. TOF sağlam henüz düşük maliyetli HRMS MSI-CE-Bayan kullanırken nontargeted tarama/uyuşturucu gözetim uygulamaları için ideal bir hızlı veri toplama ile temsil eder. Örneğin, etkileyici çözünürlük çeşitli izobarik/isomeric DoA ve yapısal İzomerler üç opioid yapısal İzomerler, yani norhydrocodone, hydromorphone ve morfin (şekil 1B) dahil olmak üzere kendi metabolitleri için elde edilir. Bu durumda, 30 tepeler bir ilaç karışımı 10 bağımsız örneklerinden örnek etkilenmişimdir algılanır çözüldü. Bir sentetik idrar boş/negatif idrar denetimi Ayrıca seri enjeksiyon serisi içinde bulunur (örnek pozisyon #6). Ayrıca, iki diğer izobarik opioidler, yani 6-acetylmorphine (etkin olmayan eroin metaboliti) ve nalokson (opioid aşırı doz acil tedavi için kullanılan bir opioid reseptör antagonisti) tam tam inceden inceye gözden geçirmek veri alma () ile 20 farklı tepeler olarak çözümlenir Şekil 1 c). Benzer şekilde, iki amfetamin pozisyonel İzomerler tam olarak phentermine, kilo kaybı için bir iştah kesici olarak kullanılan bir reçete uyarıcı potansiyel kötüye yasadışı metamfetamin kötüye ayırmak için MSI-CE-MS çözümlenir.

Şekil 1: ayıklanan iyon electropherograms (EIE) temsilcisi DoA İzomerler/on örnekleri ve tek çalışması içinde boş bir analiz ederek, MSI-CE-MS tarafından giderilen Isobarlar için bir dizi. (A)şematik olarak MSI-CE-sentetik idrar 84-DoA panelinde kullanılan seri enjeksiyon yapılandırma gösteren Bayan. Bu çoğaltılmış ayırma yöntem 11 ayrı örnekleri ve boş hidrodinamik enjeksiyonlari alternatif bir dizi ısısını elektroforetik ayrımı iyonlar, bir tam tarama verisini tarafından takip başlatmak üzere bir arabellek electrokinetic bir iğne ile kullanır TOF-MS tarafından satın alma ile pozitif iyon modu algılama. (B) üç izobarik fonksiyonel grup opioid İzomerler (m/z 286.1438), CE, norhydrocodone, hydromorphone ve morfin gibi 10 ayrı örnek enjeksiyonları dan 30 çözümlenmiş doruklarına oluşan tarafından ayrılmış. (C) iki izobarik opioid uyuşturucular ve onların metabolitleri (m/z 328.1543), CE, 6-acetylmorphine (eroin metaboliti) ve nalokson dahil olmak üzere 10 ayrı örnek enjeksiyonları dan 20 çözümlenmiş doruklarına oluşan tarafından ayrılmış. (D) iki izobarik fonksiyonel grup amfetamin İzomerler, CE tarafından ayrılmış 20 çözümlenmiş doruklarına metamfetamin ve phentermine dahil olmak üzere 10 ayrı örnek enjeksiyonları dan oluşan. Her durumda, negatif idrar denetimleri/boşlukları MSI-CE-Bayan altıncı örnek pozisyonda tanıttı örnek etkilenmişimdir ihmal edilebilir kanıt vardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

DoA ekran için bir seri enjeksiyon yapılandırmada MSI-CE-MS 84-uyuşturucu paneli karışımı önerilen kullanılan kesme konsantrasyon düzeyleri (olarak tüm metinler için ilk enjeksiyon pozisyon) Eleme 10 temsilcisi idrar randomize bir analiz tarafından takip Klinik depresif hastaların bilinen reçete tarihi ile örnekleri. Örneğin, olumlu bir tarama testi sonucu metadon için (m/z 310.2165) hastadan #208 (şekil 2A) tarafından hangi metadon-d3 ile düşük ile comigrates (enjeksiyon #9 kaynaklanan) bir büyük sinyal tepe algılamaya sonucuna olduğunu kitle hata (< 5 ppm). Diğer sinyalleri diğer idrar örneklerinde aynı çalıştırmak içinde tespit edilir. Metadon konsantrasyon, ölçülen iyon yanıt oranı örnek (enjeksiyon #9) başvuru ilaç karışımı/QC (enjeksiyon #1) ile karşılaştırırken 13 x önerilen kesme sınırı aşıyor ve misiIIerden idrar seyreltme faktörü tarafından düzeltildi. Böylece, bu sonuç metadon bakım terapisi hastanın bağlılığı teyit eder. Kanıt nonprescribed amfetamin alımı (şekil 2B) yükseltilmiş amfetamin düzeyleri tarafından gösterilir (m/z 136.1121) sadece MSI-CE-MS çalışması içinde bir hastada (hastada #50, enjeksiyon #11) algıladı. Ölçülen konsantrasyon biraz önerilen kesme düzeyleri aşıldı (1.3 x). Bu amfetamin-d5 ile comigrates ve moleküler formülü üst sıradaki maç ile düşük bir kitle hata vardı. Antidepresan venlafaksin için pozitif test sonucu (m/z 278.2115), bir seçici serotonin-norepinephrine reuptake inhibitörü de #281 (enjeksiyon #6) hastada gösterdi. Bu durumda, önerilen kesme düzeyleri (15 x) konsantrasyonu aşıyor, bu tarafından doğru yığın - ya da moleküler formülü-eşini, comigrating venlafaksin-d6 (şekil 2C) ile birlikte tanımlanır. İkinci ölçüt da sadece doğru kütlesiyle güvenerek zaman dikkat ihtiyacını vurgular EIE izleme içinde tespit bilinmeyen bir isobar için bir araya geldi değil. Ayrıca, kesin tespiti, yanı sıra, nöropatik ağrı tedavisinde reçete reçete pregabalin anksiyete Genelleştirilmiş, de hasta için #309 gösterdi, onun fena halde yüksek konsantrasyon (64 x) Yukarıda önerilen temel kesme düzeyleri (şekil 2B). Bu ancak, dokuz diğer içinde aynı analiz hasta idrar numunelerinin çalışılabilmesi algılanır değil. Benzer şekilde diğer ekran-pozitif durumlarda, enjeksiyon #4, MSI-CE-MS tarafından analiz tüm idrar örneklerinde dahil pregabalin-d6 ile comigrates.

Şekil 2: ayıklanan iyon electropherograms (EIE) için gelen bir kohort temsilcisi ekranı pozitif idrar uyuşturucu testi sonuçları 10 depresyona hasta olarak bir dizi doğruladı ne zaman istimal MSI-CE-84-uyuşturucu panelde içeren MS, tavsiye cut-off düzeyi, iç başvuru/QC hizmet veren ilk örnek enjeksiyon pozisyon olarak enjekte. (A) EIE yerleşimi metadon-hangi metadon ile comigrates, d3 için karşılık gelen tek bir idrar örneği vurgulama (enjeksiyon pozisyon #9) kadar kesme düzeyi aşan metadon konsantrasyonları yüksek. (B) EIE yerleşimi amfetamin-hangi amfetamin ile comigrates, d3 için karşılık gelen tek bir idrar örneği vurgulama (enjeksiyon pozisyon #11) kesme seviyelerinin üzerinde konsantrasyonları yüksek. (C) EIE yerleşimi venlafaksin-hangi venlafaksin ile comigrates, d6 için karşılık gelen tek bir idrar örneği vurgulama (enjeksiyon pozisyon #6) kesme seviyelerinin üzerinde konsantrasyonları yüksek. (D) EIE yerleşimi pregabalin-hangi pregabalin ile comigrates, d6 için karşılık gelen tek bir o idrar örneğini vurgulama (enjeksiyon pozisyon #4) fena halde kesme düzeyleri aşan konsantrasyonları yüksek. Tüm İdrar numuneleri doğrudan bir beş kat seyreltme sonra deiyonize su ile birlikte bir eşleşen ek d analiz edildi-(varsa) olduğunu. D-ISS ile düşük bir kitle hata ile comigrates bir ilaç bir ekran-pozitif sonuç MSI-CE-MS karşılık gelen (< 5 ppm) ve doğru moleküler formülü, kimin konsantrasyon iç başvuru/QC olarak aynı çalışması içinde analiz kesme aşıyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

DoA ve onların metabolitleri mutlak miktar da MSI-CE-dış kalibrasyon eğrileri, dayalı tek bir çalışma içinde hızla iktisap DoA için calibrant kullanılan standartlar kullanarak MS elde edilir. Örneğin, seri seyreltme karışımı ile birlikte bir eşleşen bir 84-uyuşturucu calibrant d-yeri sabit bir konsantrasyon karmaşık idrar örneklerinde güvenilir bir kantitatif analiz sağlar. Bu potansiyel matris indüklenen iyon bastırma veya geliştirme için aynı zamanda örnek arasında kılcal enjeksiyon hacmindeki değişimler dengeler. Durumlarda bir eşleşen d-IS ticari olarak kullanılamıyor veya maliyet-engelleyici bazı DoA için bir vekil olduğunda daha önce gösterildiği gibi aynı uyuşturucu sınıf veya sentetik bileşik değil bulunan idrar (F-Phe), içinde bir d-IS veri normalleştirme için kullanılan ¹⁴. temsilcisi EIEs ve dış kalibrasyon eğrileri Oksikodon için şekil 3AiçindeBgösterilir. ve sitalopram şekil 3 c, Diçin. Bunlar yaygın ağrı kesici ve antidepresanlar, sırasıyla, kötüye potansiyeli ile reçete edilir. Onların eşleştirme göreli iyon yanıt oranları d-değil ölçülür. Bu durumda, MSI-CE-MS, beş farklı uyuşturucu calibrants, oluşan bir seri enjeksiyon yapılandırmada analiz sentetik idrar boş birlikte tek çalışması içinde yinelenen içinde. Genel olarak, iyi doğrusallık (R² > 0.990) üzerinde 20-fold bir konsantrasyon aralığı DoA ve onların metabolitleri (Yani, Katyonik alkoloidler) çoğunluğu tespiti için yeterli hassasiyetle 84-uyuşturucu paneli içinde elde edildi ¹⁴. onların protonated moleküler iyon [MH⁺] onların tarama kesme yukarıda sınırları olarak her durumda, uyuşturucu metabolitleri algılanır (> 50 ng/mL), zavallı iyonlaşma verimlilik altında var bazı asidik/tarafsız ilaçlar dışında kannabinoidlerin (örneğin, THC-COOH), barbitüratlar (örneğin, raporun) ve carbamates (örneğin, carisoprodol) gibi pozitif iyon modu.

Şekil 3: ayıklanan iyon electropherograms (EIE) temsilcisi DoA miktar için bir dizi. Bu onların göreceli iyon yanıt oranı ile temel dış kalibrasyon eğrileri oluşturarak yapılır bir eşleşen bir d-20-fold bir doğrusal dinamik aralığında olduğunu. (A)yinelenen bir beş nokta kalibrasyon eğrisi için Oksikodon calibrants birlikte Oksikodon-d3 ve boş bir enjeksiyon. (B) dış kalibrasyon eğrisi Oksikodon, duyarlılık (yamaç) ve doğrusallık (R²), türetmek için doğrusal regresyon ±1σ temsil eden hata çubukları ile takip için (n = 4). (C) yinelenen bir beş nokta kalibrasyon eğrisi birlikte sitalopram-d6 ve boş bir sitalopram calibrants için enjeksiyon. (D) dış kalibrasyon eğrisi sitalopram, duyarlılık (yamaç) ve doğrusallık (R²), türetmek için doğrusal regresyon hata ile takip için barlar temsil eden ±1 SD (n = 4). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Geleneksel Kromatografik ayrımları genellikle bir tek örnek enjeksiyon başına, sonra sütun yenileme karmaşık ilaç karışımları ve çözümlemek için bir degrade elüsyon tarafından takip güveniyor. Bu gereksinimleri temelde örnek üretilen iş ve görev sınırı en uygun sütun değiştirme programları kullanırken bile döngüsü. Bu bağlamda, böylece paralel olarak gerçekleştirilen ama doğrulayıcı veya tercihen ikinci kademe olarak kullanılacak yüksek miktarda idrar uyuşturucu analiz için işyeri, toksikoloji veya tedavi izleme uygulamaları GC-MS/MS ve giderek, LC-MS/MS tarafından ne zaman test gerekli (örneğin, yasal veya tıbbi bağlamında). Bu çok daha yüksek sermaye yatırımları ve operasyonel maliyetleri yanı komplikasyonlar veri analizi ile ne zaman bir akredite edilmiş laboratuvara içinde birden çok enstrümantal platformlar arasında analiz örnekleri karşılaştırma kaynaklanmaktadır. Sonuç olarak, uzun hala eğilimli yanlış-pozitif ve yanlış-negatif birçok ilaç sınıflar arasında ortaya çıkan tasarımcı ilaçlar için sınırlı erişim hakkıyla Antikor Reaktif olmasına rağmen rutin uyuşturucu taraması birincil yöntem kalır. Önceki çalışmalarda çoğaltılmış renk ayrımları MSI-CE-Bayan üzerinde dayalı bir büyüklük kadar örnek işlem hacmi artırmak için basit bir çözüm sunmak gösterdi. Ayrıca, etkili toplu düzeltme ve kalite kontrol^12,13,14uygulamasına dayalı yüksek veri sadakat ile roman veri iş akışları biyomarker keşif için tasarımı için bu yaklaşım sağlar. Ancak, MSI-CE-MS 10 veya daha fazla seri hidrodinamik enjeksiyonları getirilmesi selectivity DoA ve onların metabolitleri analiz ederken uzlaşma olabilir yüksek verimli ayrımları korumak için gerekli etkin kılcal damar uzunluğu kısaltır insan idrar.

Ayırma yararlanır böylece önemli uyuşturucu Isobarlar/İzomerler çözünürlük kullanırken geliştirme tam kılcal damar uzunluğu (120 cm), öyle ki burada, biz electrokinetic enjeksiyonu her hidrodinamik örnek enjeksiyon takip BGE tanıttı tam-veri toplama TOF-MS (şekil 1A) tarafından tarama. Bir son rapor¹⁴ile karşılaştırıldığında, daha iyi çözünürlük için birkaç önemli izobarik/isomeric DoA ve onların metabolitleri, hangi büyük uyuşturucu panelleri için eleme önemlidir elde edilir. Üç benzer opioid uyuşturucular/metabolitleri (şekil 1B), iki ilgisiz opioid Isobarlar (şekil 1 c) ve iki metamfetamin gibi birkaç önemli yapısal/fonksiyonel grup İzomerler çözünürlüğe mesela gerçekleştirildi pozisyonel İzomerler (şekil 1 d). Her durumda, farklı calibrant çözümleri aynı çalıştırmak içinde seri enjeksiyon üzerinden örnek etkilenmişimdir negatif idrar kontrolü/boş tarafından doğruladı gibi önemli değildir. Ayrıca, geliştirilmiş çözünürlük de belirli d-ISS kotinin-d3 ve 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EDVE-d3 ve imipramine, gibi paneli içindeki izobarik ilaçlarla ilgili birkaç arası etkileşimler için gerçekleştiği norfentanyl-d5 ve ketamin, kodein-d6 ve sertralin ve kokain-d3 ve zolpidem. Bu sonucu yanı sıra büyük arka plan idrar etkileşimler izobarik partiküllü uyuşturucu paneli içinde bu çalışmada (örneğin, noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/Metifenol), daha iyi çözüldü biçimde genişletilir (Örneğin , kaynak parçası kreatinin amfetamin ile iyonları)¹⁴. Nitekim, erişim için belirli bir DoA sözde kimliği karşılaması için iki dik parametre yanlış-mutlak izobarik etkileşimler, yani doğru nedeniyle kitle comigration d-ISS ile kombine azaltılması için önemlidir. Ayrıca, bir veya daha fazla biotransformed metabolitleri üst ilaç hydroxylated, demethylated veya bozulmamış glucuronide ilaç gibi aynı örnek içinde tespiti conjugate(s), daha fazla güven doğru genişleyen pencere süre uyuşturucu kimlik ekler algılama için.

İdrar uyuşturucu tarama için önerilen kesme düzeyleri DoA (50'den 1000 ng/mL arasında) farklı sınıflar dozları, toksisite ve arka plan etkileşimler, bağlı için yönergelere dayalı yöntem önyargı azaltmak için değişkenlik Madde bağımlılığı ve ruh sağlığı Hizmetleri Yönetimi (SAMHSA)¹⁴. Algılamak ve DoA çeşitli sınıfları doğrudan idrarda minimal örnek Önarıtma ile tanımlamak MSI-CE-MS için potansiyel bir grup bilinen reçete kayıt depresyona hastalarının uygulandı. Metadon (reçete), amfetamin (nonprescribed/yasadışı), (reçete) venlafaksin ve seyreltilmiş henüz nonhydrolyzed, idrar örneklerinde pregabalin (reçete) kesin tanımlaması MSI-CE-Bayan kullanırken gösterilmiştir. Bu belirli enjeksiyon konumuna göreli olarak önerilen ilk örnek konumundan tanıtılan 84-ilaç karışımı tespit bir ilacın doğrudan karşılaştırma dayalı bir iç başvuru/QC ve pozitif kontrol hizmet veren cut-off düzeyi Eleme (Şekil 2). Ayrıca, mutlak uyuşturucu miktar onun d göre bir ilaç için iyon yanıt oranına dayanarak dış kalibrasyon eğrileri (şekil 3) kullanılarak ölçülen zaman mümkün olduğunu-olduğunu. En Kromatografik ayrımları bir d arasındaki geçiş zaman farklar etkileyen döteryum etkisi yoktur-olduğunu ve onun nondeuterated uyuşturucu CE ücretsiz çözümde benzer elektroforetik mobilities sahip beri. Nitekim, DoA geçiş davranışını doğru yani moleküler birim ve etkili ücret (pK_bir)¹⁴onların temel fizikokimyasal özellikleri/kimyasal yapısına göre CE, modellenmiş. Birçok ilaç Ayrıca önemli ikincil metabolizma atılımı idrar (örneğin, morfin glucuronide), tarama kesme düzeyleri ayarlama karşılaştırıldığında onların ölçülen konsantrasyonları daha düşük olduğu gibi beklenen gerektirir önce meydana beri enzim hidroliz toplam uyuşturucu algılama için kullanmak yöntemleri. Meşru ekran-pozitif durumlarda daha fazla tarafından onaylanır "seyreltik-ve-ateş" idrar uyuşturucu testi, maliyeti/zaman, örnek işleme ve potansiyel bir önyargı veya toplu iş çeşitleri eksik enzim hidroliz nedeniyle düşürmenin yanı sıra büyük bir yararı olur aynı örnek içinde bir veya daha fazla ilgili uyuşturucu metabolitleri olarak algılanması. Bu da "hızlı" metabolize veya kısa yarı-ömrü olan reçete/yasadışı uyuşturucu için algılama arttırırken farmakokinetik ve optimum doz gereksinimleri bireysel hastalar için ilaç içine daha derin anlayışlar sağlar. Bir eşleme ile Ayrıca, comigration d-çalış iki önemli işlevi güvenilir ilaç ne zaman eleme için MSI-CE-Bayan kullanıyor — yani, ayrıca iyon farklılıkları için düzeltme sırasında tam örnek enjeksiyon konumu (Yani, hasta #) tanımlar Yanıt/enjeksiyon birimler için geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk.

Gelecek iş için yüksek miktarda idrar uyuşturucu testi QC/QA ile gerektiği gibi HRMS için birleştiğinde çoğaltılmış renk ayrımları otomatik veri işleme kolaylaştırmak için özelleştirilmiş yazılım araçları geliştirmek amaçlamaktadır. MSI-CE-Bayan sıkı doğrulama DoA geniş spektrumlu taranması için Ayrıca yüksek riskli hastalar daha büyük bir kohort arasında objektif reçete ilaç bağlılık ve potansiyel kötüye/uzlaşma olabilir ikame değerlendirmek için araştırılır tedavi etkinliği, hasta güvenliği ve/veya psikiyatrik değerlendirme/tanı. Asidik/Anyonik sınıflarını DoA ve onların metabolitleri tamamlayıcı bir analizini de MSI-CE-MS tarafından doğal/sentetik kannabinoidlerin kapsamlı tarama için gerektiği gibi negatif iyon modu algılaması ile alkali koşullarda yapılır. Bu Kanada ve birkaç ABD eyaletinden arasında eğlence marihuana yasallaştırma başgösteren halk sağlığı etkileri göz önüne alındığında önemlidir. Diğer yaşam tarzı ya da diyet Etkilenmeler daha iyi tespit edilebilir, ancak bile idrar örnekleri takip test etmek için kullanılabilir zaman artık geriye dönük analiz örnekleri gerçekleştirilebilir tam inceden inceye gözden geçirmek veri toplama TOF-MS tarafından önemli bir avantajı olduğunu ilaç tedavisi için fark yanıt-e doğru anlamak. Özet olarak, bir hızlı henüz doğru ilaç gözetleme yöntemi MSI-CE-MS tarafından geleneksel hedeflenen uzun, hem de doğrudan infüzyon/ortam için önemli avantajlar çözümlerken etkileşimler/önyargı yatkındır iyonlaşma-MS/MS yöntem sunar Genişletilmiş paneller DoA ve onların metabolitleri artan maliyetlerle karmaşık biyolojik örneklerde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7100 Capillary Electrophoresis System	Agilent Technologies Inc.	G7100A	CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer	Agilent Technologies Inc.	G6230B	HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit	Agilent Technologies Inc.	G1603A	CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser	Agilent Technologies Inc.	G1310B	Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter	Agilent Technologies Inc.	5813-4620	Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker	Microsolv Inc.	07200-S	Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies Inc.	TSP05375	Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)	Cerilliant Inc.	Miscellaneous	Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)