Summary

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Published: February 05, 2019
doi:

Summary

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in deoxyribonucleic acid (DNA). Dit protocol beschrijft hoe het te doen plaats-geleide mutagenese met een 2-step en 3-staps polymerase-kettingreactie (PCR) gebaseerde benadering, die is van toepassing op elk fragment van DNA van belang.

Abstract

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in het DNA te onderzoeken van de wisselwerking tussen kleine niet-coderende RNA acid (sRNA) moleculen en doel messenger RNAs (mRNAs). Daarnaast wordt plaats-geleide mutagenese gebruikt voor het toewijzen van specifieke proteïne bandplaatsen aan RNA. Een 2-stap en 3 introductie van de PCR op basis van mutaties wordt beschreven. De aanpak is relevant voor alle eiwit-RNA en RNA-RNA interactie studies. Kortom, de techniek is gebaseerd op het ontwerpen van inleidingen met de gewenste mutation(s), en door middel van 2 of 3 stappen van PCR synthese van een PCR-product met de mutatie. Het PCR-product wordt vervolgens gebruikt voor het klonen. Hier beschrijven we hoe u kunt plaats-geleide mutagenese met zowel de 2 – en 3-stap-benadering om mutaties op de sRNA, McaS en de mRNA, csgD, RNA-RNA en de RNA-eiwit interacties te onderzoeken uitvoeren. We passen deze techniek om te onderzoeken van RNA interacties; de techniek is echter die van toepassing zijn op alle mutagenese studies (bijv. DNA-eiwit interactie, aminozuur vervanging/verwijderen/toevoeging). Het is mogelijk om elke vorm van mutatie met uitzondering van niet-natuurlijke grondslagen, maar de techniek is alleen van toepassing als een PCR-product kan worden gebruikt voor downstream toepassing (bijvoorbeeld klonen en sjabloon voor verdere PCR).

Introduction

DNA wordt vaak genoemd de blauwdruk van een levende cel omdat alle structuren van de cel zijn gecodeerd in de opeenvolging van haar DNA. Nauwkeurige replicatie en DNA herstelmechanismes voorkomen dat slechts zeer lage tarieven van mutaties, die is van essentieel belang voor de instandhouding van de juiste functies van gecodeerde genen. Wijzigingen van de opeenvolging van DNA kunnen opeenvolgende functies op verschillende niveaus, beginnend met DNA (erkenning door de transcriptiefactoren en restrictie-enzymen), vervolgens RNA (base-paar complementariteit en secundaire structuur verbouwingen) en/of eiwit (amino zure vervangingen, weglatingen, toevoegingen of frame-verschuivingen). Terwijl vele mutaties genfunctie niet aanzienlijk beïnvloeden, kunnen sommige mutaties in het DNA grote gevolgen hebben. Plaats-geleide mutagenese is dus een waardevol instrument voor het bestuderen van het belang van specifieke DNA sites op alle niveaus.

Dit protocol beschrijft een gerichte mutagenese aanpak gebruikt om specifieke mutaties. Het protocol is gebaseerd op twee verschillende strategieën van de PCR: een 2-step of een 3-stap-PCR. De 2-staps-PCR is van toepassing als de gewenste mutatie dicht bij de 5′ eindigt of het einde 3′ van het DNA van belang ligt (< 200 basenparen (bp) vanaf het einde) en de 3-staps PCR geldt in alle gevallen.

In de benadering van de PCR 2-step 3 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 3, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een enkele primer is ontworpen om op te nemen van de mutatie. De invoering van de primer (primer 2) mutatie moet een omgekeerde oriëntatie als de mutatie dicht bij het 5′-eind en een voorwaartse richting ligt als de mutatie dicht bij de 3′-eind ligt. In de eerste stap van de PCR versterkt primer 1 + 2 of 2 + 3 een klein fragment dicht bij de 5′ end of 3′ end, respectievelijk. Het resulterende PCR product wordt dan gebruikt als een primer in stap twee met primer 1 of 3, dus wat resulteert in een PCR-product met een mutatie in het DNA van belang (figuur 1A).

In de 3-staps PCR, 4 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 4, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een reeks inleidingen is ontworpen voor het opnemen van specifieke mutaties met overlappende complementariteit (inleidingen 2 en 3, reverse en doorstuurt, respectievelijk). In stap één en twee, inleidingen 1 + 2- en 3 + 4 versterken het einde 5′ en 3′. In stap drie, de resulterende PCR producten uit stap 1 en 2 worden gebruikt als sjablonen en versterkt met inleidingen 1 + 4. Het resulterende PCR product is dus het DNA van belang met de gewenste Mutatie (figuur 1B).

Terwijl de gemuteerde DNA kan worden gebruikt voor elke stroomafwaartse toepassing, wordt dit protocol beschreven hoe opnieuw het combineren van het DNA in een klonen vector. Het gebruik van klonen van vectoren heeft verschillende voordelen zoals gebruiksgemak klonen en specifieke experimentele toepassingen afhankelijk van de eigenschappen van de vector. Deze functie wordt vaak gebruikt voor RNA interactie studies. Een andere techniek voor RNA interactie studies is structurele sonderen van het RNA in complex met een andere RNA1,2 of eiwit3,4. Echter, structurele indringende wordt alleen uitgevoerd in vitro overwegende dat plaats-geleide mutagenese en latere klonen toestaan voor interactie studies in vivo.

Plaats-geleide mutagenese is uitgebreid gebruikt voor RNA interactie studies zoals hier gepresenteerd. Echter de belangrijkste met betrekking tot 2 – of 3-staps PCR-methode is van toepassing op elk stuk van DNA, en dus niet alleen beperkt tot RNA-interactie studies.

Om te illustreren de techniek en het mogelijke gebruik ervan, wordt karakterisering van regio’s belangrijk voor verordening van de post-transcriptional van het mRNA, csgD, van Escherichia coli (E. coli) gebruikt. In E. coli, csgD wordt gericht door de kleine niet-coderende RNA, McaS, in samenwerking met een eiwit, Hfq, te onderdrukken van eiwit-expressie van CsgD2,4,5. De techniek wordt gebruikt voor het invoeren van mutaties voor de regio van base-paring tussen csgD en McaS, en op de site van de bindende Hfq van csgD. Het verkregen DNA wordt vervolgens gekloond in een vector geschikt voor latere experimenten. Downstream toepassingen van de techniek omvatten zowel in vivo en in vitro experimenten. Ter illustratie, voorbeeld 1 is gekenmerkt in vivo met behulp van een westelijke vlek assay en voorbeeld 2 in vitro met behulp van een kwantitatieve analyse van elektroforetische mobiliteit, shift (EMSA) wordt gekenmerkt. In beide gevallen is geïllustreerd hoe plaats-geleide mutagenese kan worden gebruikt in combinatie met andere technieken voor het maken van biologische conclusies over een gen van belang.

Protocol

1. vector selectie Kies een vector naar stroomafwaartse expermenteren uitvoeren. Elke vector is van toepassing voor deze 2 – en 3-staps PCR methode. Op basis van de keuze van vector, kies passende enzymen van de beperking voor het klonen. 2. primer ontwerp voor site gericht mutagenese Kiezen tussen ofwel de 2-step of 3-step PCR-strategie (2-step is alleen voor mutaties < 200 bp uiteinden van DNA van belang). Voor de 2-staps-PCR, gaat u naar stap 2.2 en ga na…

Representative Results

Te onderzoeken van RNA interacties met betrekking tot post-transcriptional regulering van csgD, een dubbele vector setup werd gekozen: één aan de csgD express mRNA en andere kleine niet-coderende RNA, McaS uitspreken. csgD in pBAD33, oftewel een arabinose afleidbare-medium-kopie plasmide met chlooramfenicol weerstand werd gekloond en McaS werd gekloond in mini R1 pNDM220, oftewel een plasmide isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) afleidbare laag kopie …

Discussion

Plaats-geleide mutagenese heeft een breed scala van verschillende toepassingen, en hier, representatieve resultaten van een in vivo en in vitro experiment werden opgenomen als voorbeelden van hoe te maken van biologische conclusies met behulp van de techniek. Plaats-geleide mutagenese geweest voor lang de gouden standaard voor RNA interactie studies. De sterkte van de techniek ligt in de combinatie van de invoering van de relevante mutaties met stroomafwaartse tests en experimenten (bijv. westelijke vlek of EMSA) conclus…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank Universiteit van Zuid-Denemarken open access beleid subsidies.

Materials

Anti-GroEL antibody produced in rabbit Merck G6532 Primary antibody
Azure c200 Azure NA Gel imaging workstation
Custom DNA oligo Merck VC00021
DeNovix DS-11 DeNovix NA Spectrophotometer for nucleic acid measurements
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Scientific R0611
Ethidium bromide solution 1 % Carl Roth 2218.1
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix Fermentas SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi Gerard Biotech TO12 Dialysis tubes for electro elution
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell Bio-Rad 1704406 Horizontal electrophoresis system
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Merck F3165 Primary antibody
Mouse Immunoglobulins Dako Cytomation P0447 HRP conjucated secondary antibody
NucleoSpin miRNA Macherey Nagel 740971 RNA purification
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Scientific NP0323BOX Bis-Tris gels for protein separation
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S DNA polymerase
PowerPac HC High-Current Power Supply Bio-Rad 1645052
Rabbit Immunoglobulins Dako Cytomation P0448 HRP conjucated secondary antibody
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
SigmaPlot Systat Software Inc NA Graph and data analysis software tool
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096 PCR machine
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Ligase
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201S
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) Thermo Scientific B49

References

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  3. Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
  5. Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  6. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  7. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  8. . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  9. . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  10. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  12. Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
  13. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  14. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

Play Video

Cite This Article
Andreassen, P. R., Pettersen, J. S., Jørgensen, M. Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (144), e58996, doi:10.3791/58996 (2019).

View Video