Optisk kohærens tomografi (OCT), en tre-dimensionel tænkelig teknologi, blev brugt til at overvåge og karakterisere vækst kinetik af flercellede tumor spheroids. Præcise volumetriske kvantificering af tumor spheroids ved hjælp af en voxel tælle tilgang og etiket-fri dødt væv påvisning i spheroids baseret på iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast, blev demonstreret.
Tumor spheroids er blevet udviklet som en tre-dimensionelle (3D) celle kultur model i kræft forskning og anti-cancer drug discovery. Men i øjeblikket, høj overførselshastighed imaging modaliteter udnytte lyse felt eller fluorescens detektion, er afskåret fra løse den samlede 3D-struktur af tumor klumpformet på grund af begrænset lys penetration, diffusion af fluorescerende farvestoffer og dybde-resolvability. For nylig, viste vores lab brugen af optisk kohærens tomografi (OCT), en etiket-fri og ikke-destruktiv 3D imaging modalitet for at udføre langsgående karakterisering af flercellede tumor spheroids i en 96-brønd plade. OCT var i stand til at opnå 3D morfologiske og fysiologiske oplysninger af tumor spheroids vokser op til ca. 600 µm i højden. I denne artikel viser vi en høj overførselshastighed OCT (HT-OCT) billedbehandlingssystem, der scanner hele multi godt pladen og henter 3D OCT data af tumor spheroids automatisk. Vi beskrive detaljerne i HT-okt system og byggeri retningslinjer i protokollen. Fra 3D OCT data, man kan visualisere den overordnede struktur af sfæroide med 3D afsmeltet og ortogonale skiver, karakteriserer den langsgående vækstkurve af tumor klumpformet baseret på de morfologiske oplysninger for størrelse og mængde, og overvåge vækst af regionerne døde celler i tumor klumpformet baseret på optiske iboende dæmpning kontrast. Vi viser, at HT-OLT kan bruges som en høj overførselshastighed imaging modalitet for stof screening samt kendetegner biofabricated prøver.
Kræft er den næststørste årsag til dødsfald i verden1. Udvikle lægemidler rettet mod kræft er af afgørende betydning for patienter. Dog er det anslås at mere end 90% af nye anti-cancer medicin ikke i udviklingsfasen på grund af manglende effektivitet og uventede toksicitet i kliniske forsøg2. En del af grunden kan henføres til brugen af simple todimensionale (2D) celle kultur modeller for sammensatte screening, som giver resultater med begrænset prædiktive værdier af sammensatte effekt og toksicitet for de følgende faser af drug discovery2 , 3 , 4. seneste, tre-dimensionelle (3D) tumor klumpformet modeller har udviklet for at give klinisk relevante fysiologiske og farmakologiske data for anti-cancer drug discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Da disse spheroids kan efterligne væv-specifikke egenskaber af tumorer i vivo, som næringsstoffer og ilt kan gradient, hypoksiske kerne samt drug modstand19, brugen af disse modeller potentielt forkorte drug discovery tidslinjer, reducere udgifterne til investeringer, og bringe nye lægemidler til patienter mere effektivt. En kritisk tilgang til evaluering af sammensatte effekten i 3D tumor klumpformet udvikling er at overvåge klumpformet vækst og fornyet under behandlinger9,26. For at gøre dette, er kvantitative beskrivelser af tumor morfologi, dens diameter og mængde med høj opløsning billeddiagnostiske modaliteter, bydende nødvendigt.
Konventionelle billeddiagnostiske modaliteter, som lyse-felt, fase kontrast7,9,22,24og Fluorescens mikroskopi8,9,16, 18,22 kan give en måling af den sfæroide diameter, men kan ikke løse den overordnede struktur af klumpformet i 3D-rum. Mange faktorer bidrager til disse begrænsninger, herunder udbredelsen af den dybdeborende lys i klumpformet; Diffusion af de fluorescerende farvestoffer i klumpformet; udsender fluorescerende signaler fra spændte fluorescerende farvestoffer inde eller på den modsatte overflade af klumpformet på grund af stærk absorption og spredning; og dybde-resolvability af disse imaging modaliteter. Dette fører ofte til en unøjagtig volumen måling. Udvikling af nekrotisk kernen i spheroids efterligner nekrose i i vivo tumorer6,10,15,19,25. Denne patologiske funktion er usandsynligt gengivet i 2D celle kulturer19,25,27,28. Med en klumpformet størrelse større end 500 µm i diameter, en tre-lags koncentriske struktur, kan herunder et ydre lag af celler, et midterste lag af inaktiv celler og et nekrotisk kerne, observeres i klumpformet6,10 ,15,19,25, på grund af mangel på ilt og næringsstoffer. Levende og døde celle fluorescens imaging er standardmetoden til at mærke grænsen for de nekrotiske kerne. Dog igen, hindrer gennemføringer af både disse fluorescerende farvestoffer og synligt lys potentiale at sonde ind i nekrotisk kernen til at overvåge udviklingen i dens aktuelle form.
En alternativ 3D imaging modalitet, er optisk kohærens tomografi (OCT) indført for at karakterisere tumor spheroids. OCT er en biomedicinsk billedbehandling teknik, der er i stand til at erhverve etiket-fri, ikke-destruktiv 3D data fra op til 1-2 mm dybder i biologisk væv29,30,31,32,33 ,34. OLT anvender lav-sammenhæng interferometri at opdage back-spredt signaler fra forskellige dybder af prøven og giver rekonstruerede dybde-løst billeder på mikro-niveau rumlige resolutioner i sideretningen og lodret retning. OCT har været udbredt i oftalmologi35,36,37 og angiografi38,39. Tidligere undersøgelser har brugt OCT at observere morfologi af in vitro- tumor spheroids i basalmembranen matrix (f.eks.Matrigel) og evaluere deres svar til Fotodynamisk terapi40,41. For nylig, etableret vores gruppe en høj overførselshastighed OCT imaging platform til systematisk overvågning og kvantificere vækst kinetik af 3D tumor spheroids i multi godt plader42. Præcise volumetriske kvantificering af 3D tumor spheroids ved hjælp af en voxel tælle tilgang og etiket-fri nekrotisk væv påvisning i spheroids baseret på iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast blev demonstreret. Dette papir beskriver detaljerne i hvordan OCT imaging platform blev bygget og ansat til at opnå høj opløsning 3D billeder af tumor spheroids. De trinvise kvantitative analyser af vækst kinetik af 3D tumor spheroids, herunder præcise målinger af klumpformet diameter og mængder, er beskrevet. Også, metoden for ikke-destruktiv påvisning af nekrotisk væv områder ved hjælp af OLT, baseret på de iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast er præsenteret.
Tumor aktivitet er særdeles relevante for dens morfologisk struktur. Lig overvågning karakteristiske vækstkurven for 2D cellekulturer, tracking vækstkurven for 3D tumor spheroids er også en konventionel tilgang til at karakterisere den langsigtede klumpformet vækst opførsel for forskellige cellelinjer. Især kan vi karakterisere drug svar ved at analysere tumor nedbrydning eller tumor genvækst direkte afspejles i vækstkurven. Derfor, kvantitativ vurdering af 3D tumor spheroids, herunder størrelse og volumen, at…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH tilskud R21EY026380, R15EB019704 og R01EB025209 og Lehigh University start fond.
Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
Reference Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Focusing Lens | Thorlabs | ||
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
1D Translational Stage | Thorlabs | ||
Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Sample Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Galvanometer | Thorlabs | ||
Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
Objective | Mitutoyo | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Polarization Controller | Thorlabs | ||
30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
Cage Rod | Thorlabs | ||
Stage | |||
3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
2D Tilting Stage | |||
Rotation Stage | |||
Plate Holder | 3D printed | ||
Spectrometer | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Component | |||
HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
Gloves | VWR | 89428-750 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
Microscope | Olympus | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Histology & IHC | |||
Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
List of Commerical OCTs | |||
SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software for Data Analyses | |||
Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |