Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.
Tumor spheroïden zijn ontwikkeld als een driedimensionale (3D) cel cultuur model in kanker onderzoek en anti-kanker drugontdekking. Echter, high-throughput imaging modaliteiten met behulp van lichte veld of fluorescentie detectie, momenteel niet in staat om op te lossen de algemene 3D-structuur van de tumor sferoïde als gevolg van de beperkte licht penetratie, verspreiding van fluorescente kleurstoffen en diepte-resolvability. Onlangs, ons lab aangetoond het gebruik van optische coherentie tomografie (OCT), een label-vrije en niet-destructieve 3D imaging modaliteit, longitudinale karakterisering van meercellige tumor spheroïden om in te voeren een 96-wells-plaat. OCT kon verkrijgen van 3D morfologische en fysiologische informatie van tumor spheroïden groeit tot ongeveer 600 µm in hoogte. In dit artikel tonen we een high-throughput okt (HT-okt) imaging systeem dat de hele multi goed plaat scant en verkrijgt 3D OCT gegevens van tumor spheroïden automatisch. Beschrijven we de details van de HT-OCT systeem en bouw de richtsnoeren in het protocol. Uit de 3D-gegevens van de OCT, een kunt visualiseren de algehele structuur van de sferoïde met 3D gesmolten en orthogonale segmenten, karakteriseren de longitudinale groeikromme van de tumor sferoïde gebaseerd op morfologische informatie van grootte en volume, en controleren van de groei van de dode cellen regio’s in de tumor sferoïde gebaseerd op optische intrinsieke demping contrast. We laten zien dat HT-OCT kan worden gebruikt als een high-throughput imaging modaliteit voor drug screening, alsmede het karakteriseren van biofabricated monsters.
Kanker is de tweede belangrijkste doodsoorzaak in de wereld1. Ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op kanker is van cruciaal belang voor de patiënten. Geschat wordt echter dat meer dan 90% van de nieuwe anti-kanker medicijnen in de ontwikkelingsfase mislukken als gevolg van een gebrek aan efficiëntie en onverwachte toxiciteit in klinische proeven2. Deel van de reden kan worden toegeschreven aan het gebruik van eenvoudige tweedimensionale (2D) cel cultuur modellen voor samengestelde voorstelling die resultaten voorzien van beperkte voorspellende waarden van samengestelde werkzaamheid en toxiciteit voor de volgende fasen van de drug discovery2 , 3 , 4. onlangs, driedimensionale (3D) tumor sferoïde modellen zijn ontwikkeld voor het klinisch relevante fysiologische en farmacologische gegevens leveren voor anti-kanker drug discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Aangezien deze spheroïden weefsel-specifieke eigenschappen van tumoren in vivo nabootsen kunnen, zoals voedingsstoffen en zuurstof kunt kleurovergang, hypoxische kern, alsmede drug weerstand19, het gebruik van deze modellen mogelijk verkorten drug discovery tijdlijnen, verminderen van de kosten van investeringen, en breng nieuwe geneesmiddelen aan patiënten effectiever. Een kritische benadering bij de evaluatie van de werkzaamheid van de samengestelde in 3D tumor sferoïde ontwikkeling is het monitoren van de groei van de sferoïde en herhaling onder behandelingen9,26. Om dit te doen, zijn kwantitatieve karakterisaties van de morfologie van de tumor, waarbij de diameter en het volume met de hoge resolutie beeldvormende modaliteiten, absoluut noodzakelijk.
Conventionele beeldvormende modaliteiten, zoals helder-veld, fase contrast7,9,22,24, en fluorescentie microscopie8,9,16, 18,22 kan zorgen voor een meting van de sferoïde diameter maar niet het oplossen van de algehele structuur van de sferoïde in 3D-ruimte. Vele factoren dragen bij aan deze beperkingen, met inbegrip van de penetratie van het indringende licht in de sferoïde; verspreiding van de fluorescente kleurstoffen in de sferoïde; emitterende fluorescerende signalen van opgewonden fluorescente kleurstoffen binnen of op het tegenovergestelde oppervlak van de sferoïde als gevolg van de sterke absorptie en verstrooiing; en diepte-resolvability van deze beeldvorming modaliteiten. Dit leidt vaak tot een onjuiste volumemeting. Ontwikkeling van de necrotisch kern in spheroïden bootst necrose in in vivo tumoren6,10,15,19,25. Deze pathologische functie is onwaarschijnlijk gereproduceerd in 2D cel culturen19,25,27,28. Met een sferoïde grootte groter dan 500 µm in diameter, een concentrische structuur van drie lagen, kan met inbegrip van een buitenste laag van de delende cellen, een middenlaag van zwakke cellen en een necrotische kern, worden waargenomen in de sferoïde6,10 ,15,19,25, wegens gebrek aan zuurstof en voedingsstoffen. Levende en dode cel fluorescentie beeldvorming is de standaardbenadering op het etiket van de grens van de necrotisch kern. Echter, nogmaals, doorboringen van zowel deze fluorescente kleurstoffen en zichtbaar licht belemmeren het potentieel om de sonde in de necrotische kern zijn ontwikkeling in de werkelijke vorm te volgen.
Een alternatieve 3D imaging modaliteit, is optische coherentie tomografie (OCT) ingevoerd om het karakteriseren van de spheroïden van de tumor. OCT is een biomedische beeldvormende techniek die is in staat tot het verwerven van label-vrije, niet-destructieve 3D-gegevens van 1-2 mm diepte in biologische weefsels29,30,31,32,33 ,34. OCT maakt gebruik van lage-coherence interferometrie te detecteren achterwaarts-verstrooid signalen van verschillende diepten van het monster en biedt gereconstrueerde diepte-resolved beelden met de ruimtelijke resoluties micron-niveau in zowel laterale en verticale richtingen. OCT is algemeen overgenomen in oogheelkunde35,36,,37 en angiografie38,39. Eerdere studies hebben OCT gebruikt te observeren de morfologie van in vitro tumor spheroïden in kelder membraan matrix (bijvoorbeeldMatrigel) en het evalueren van hun reacties op Fotodynamische therapie40,41. Onlangs, onze groep opgericht een high-throughput OCT imaging platform om systematisch controleren en kwantificeren van de groei-kinetiek van 3D tumor spheroïden in multi goed platen42. Precieze volumetrische kwantificering van 3D tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak en detectie van de label-vrije necrotisch weefsel in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping contrast werden gedemonstreerd. Deze paper beschrijft de details van hoe de OCT imaging platform werd gebouwd en ingezet om te verkrijgen met een hoge resolutie 3D beelden van tumor spheroïden. De stapsgewijze kwantitatieve analyses van de kinetiek van de groei van 3D tumor spheroïden, met inbegrip van nauwkeurige metingen van sferoïde diameter en volumes, wordt beschreven. Ook wordt de methode van de niet-destructieve detectie van necrotisch weefsel regio’s met behulp van de LGO, gebaseerd op de intrinsieke optische demping contrast gepresenteerd.
Tumor activiteit is zeer relevant voor de morfologische structuur. Gelijkaardig aan het toezicht van karakteristieke groeikromme voor 2D celculturen, bijhouden van de groeikromme voor 3D tumor spheroïden is ook een conventionele benadering van karakteriseren van het lange termijn sferoïde groei gedrag voor verschillende cellijnen. Wij kunnen met name de reactie van de drug karakteriseren door het analyseren van de aantasting van de tumor of tumor hergroei direct tot uiting in de groeikromme. Kwantitatieve beoordeling v…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de NSF verleent IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH grants R21EY026380, R15EB019704 en R01EB025209 en Lehigh University opstarten Fonds.
Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
Reference Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Focusing Lens | Thorlabs | ||
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
1D Translational Stage | Thorlabs | ||
Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Sample Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Galvanometer | Thorlabs | ||
Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
Objective | Mitutoyo | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Polarization Controller | Thorlabs | ||
30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
Cage Rod | Thorlabs | ||
Stage | |||
3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
2D Tilting Stage | |||
Rotation Stage | |||
Plate Holder | 3D printed | ||
Spectrometer | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Component | |||
HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
Gloves | VWR | 89428-750 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
Microscope | Olympus | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Histology & IHC | |||
Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
List of Commerical OCTs | |||
SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software for Data Analyses | |||
Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |