JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
암 연구학

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvåking av tredimensjonale svulst Spheroids bruker Optical Coherence tomografi

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

Optical coherence tomografi (OCT), tredimensjonale imaging teknologi, ble brukt til å overvåke og karakterisere vekst kinetics av flercellet svulst spheroids. Presis volumetriske kvantifisering av svulst spheroids bruker en voxel teller tilnærming og etikett-fri dødt vev påvisning i spheroids basert på indre optisk demping derimot ble vist.

Abstract

Svulst spheroids har blitt utviklet som tredimensjonale (3D) celle kultur modell i kreft forskning og anti-kreft narkotika funnet. Men foreløpig høy gjennomstrømming imaging modaliteter utnytte lyse felt eller fluorescens oppdagelsen, er ikke klarer å løse generelle 3D strukturen i svulst-formet på grunn av begrenset lys penetrasjon, spredning av fluorescerende fargestoffer og dybde-resolvability. Nylig demonstrerte vår lab bruken av optical coherence tomografi (OCT), en etikett-fri og ikke-destruktiv 3D bildeprodukter modalitet, for å utføre langsgående karakteristikk av flercellet svulst spheroids i en 96-brønns plate. Oktober var i stand til å skaffe 3D morfologiske og fysiologiske informasjon av svulst spheroids vokser opp til 600 µm i høyden. I denne artikkelen viser vi en høy gjennomstrømming OCT (HT-oktober) tenkelig system som skanner hele multi godt platen og henter 3D OCT data av svulst spheroids automatisk. Vi beskriver detaljer om HT-oktober system og bygging retningslinjene i protokollen. Fra 3D OCT data, en kan visualisere den overordnede strukturen av spheroid med 3D gjengitt og ortogonale skiver, karakteriserer langsgående vekstkurven av svulst-formet basert på morfologiske informasjonen størrelse og volum, og overvåker veksten av regionene døde celler i svulst-formet basert på optiske iboende demping kontrast. Vi viser at HT-oktober kan brukes som en høy gjennomstrømming tenkelig modalitet for narkotika screening som karakteriserer biofabricated prøver.

Introduction

Kreft er den andre ledende dødsårsaken i verden1. Utvikle medisiner målretting kreft er av avgjørende betydning for pasienter. Imidlertid er det anslått at mer enn 90% av nye anti-kreft narkotika mislykkes i utviklingsfasen av effekt og uventet toksisitet i kliniske forsøk2. Noe av grunnen kan tilskrives bruken av enkel todimensjonal (2D) celle kultur modeller for sammensatte screening, som gir resultater begrenset normalverdier sammensatte effekt og toksisitet for følgende stadier av drug discovery2 , 3 , 4. nylig tredimensjonale (3D) svulst-formet modeller er utviklet for å gi klinisk relevante fysiologiske og farmakologiske data for anti-kreft narkotika discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Siden disse spheroids kan etterligne vev-spesifikke egenskaper av svulster i vivo, som næringsstoffer og oksygen kan gradient, hypoxic kjernen samt narkotika motstand19, bruk av disse modellene potensielt forkorte drug discovery tidslinjer, redusere kostnadene for investering og bringe nye medisiner til pasienter mer effektivt. En kritisk tilnærming til evaluering sammensatte effekt i 3D svulst spheroid utvikling er å overvåke spheroid vekst og Regelmessighet under behandlinger9,26. Dette er kvantitativ characterizations av svulst morfologi, med sin diameter og volum, med høy-resolution tenkelig modaliteter, viktig.

Konvensjonelle tenkelig modaliteter, for eksempel lys-feltet og fase kontrast7,9,22,24fluorescens mikroskopi8,9,16, 18,22 kan gi en måling av den spheroid diameter, men kan ikke løse den overordnede strukturen av formet i 3D-rom. Mange faktorer som bidrar til disse begrensningene, inkludert penetrasjon av undersøkelser lyset i spheroid; spredningen av fluorescerende fargestoffer i spheroid; emitting fluorescerende signaler fra glade fluorescerende fargestoffer i eller på det motsatte overflaten av spheroid sterk absorpsjon og spredning; og dybde-resolvability disse imaging modaliteter. Dette fører ofte til en unøyaktig volummåling. Utvikling av nekrotisk kjernen i spheroids etterligner nekrose i vivo svulster6,10,15,19,25. Denne patologisk funksjonen er usannsynlig gjengitt i 2D celle, kulturer,19,,25,,27,,28. Med en spheroid størrelse større enn 500 µm i diameter, en tre-lags konsentriske struktur, kan inkludert et ytre lag av voksende celler, et middels lag quiescent celler og en nekrotisk kjerne, observeres i spheroid6,10 ,15,19,25, på grunn av mangel på oksygen og næringsstoffer. Slaktede og levende celle fluorescens imaging er standard tilnærming til etiketten grensen nekrotisk kjernen. Men igjen, hindrer inntrenging av både disse fluorescerende fargestoffer og synlig lys potensial til å undersøke inn nekrotisk kjernen til å overvåke utviklingen i sin faktiske form.

En alternativ 3D bildeprodukter modalitet, er optical coherence tomografi (OCT) introdusert for å karakterisere svulst spheroids. OCT er en biomedisinsk bildebehandling teknikk som kan anskaffe etikett-fri, ikke-destruktiv 3D-data fra opptil 1-2 mm dyp biologisk vev29,30,31,32,33 ,34. OCT benytter lav-sammenheng interferometry å oppdage tilbake-spredt signaler fra forskjellige dyp prøven og gir rekonstruert dybde-løst bilder micron nivå romlig oppløsning i både laterale og vertikale retninger. OCT er allment vedtatt i Oftalmologi35,36,37 og angiography38,39. Tidligere studier har brukt OCT å observere morfologi av in vitro svulst spheroids i kjelleren membran matrix (f.eksMatrigel) og evaluere sine svar til Fotodynamisk terapi40,41. Nylig etablert vår gruppe en høy gjennomstrømming OCT tenkelig plattform for å systematisk overvåke og kvantifisere vekst kinetics av 3D svulst spheroids i flere bra plater42. Presis volumetriske kvantifisering av 3D svulst spheroids bruker en voxel telling tilnærming og etikett-fri nekrotisk vev gjenkjenning i spheroids basert på indre optisk demping kontrast ble vist. Dette dokumentet beskriver detaljer om hvordan OCT tenkelig plattformen ble konstruert og å få høyoppløselig 3D bilder av svulst spheroids. De trinnvise kvantitative analysene av vekst kinetics av 3D svulst spheroids, inkludert nøyaktige målinger av spheroid diameter og volumer er beskrevet. Også er metoden for ikke-destruktiv påvisning av nekrotisk vev regioner med oktober, basert på den iboende optisk demping kontrasten presentert.

Protocol

1. forberedelse av celler Få linjer fra kvalifisert leverandør.Merk: Bekreft at celler fra cellelinjer rundt kan danne spheroid kultur media eller ved hjelp av et substrat (kjelleren membran matrise som Matrigel). Se på litteratur9 eller utføre en runde med en pre eksperiment for en sjekk. Tine frossen cellene etter bestemte fremgangsmåten i celle-leverandør. En generell prosedyre kan finnes andre steder43. Kultur celler for 1-2 passa…

Representative Results

Høy gjennomstrømning Optical Coherence tomografi avbildning av Spheroids i en 96-brønns Plate Figur 3 viser resultatet av HT-oktober skanning av en 96-brønns plate med HCT 116 svulst spheroids på dag 3. Den sekvensielle skanningen av hele platen starter fra nederste høyre brønnen (H12). Figur 3B viser flytdiagram for programvare gjennomføringen av HT-oktober. Etter…

Discussion

Svulst aktivitet er svært relevant for morfologiske strukturen. Lik overvåking karakteristiske vekstkurve for 2D cellekulturer, sporing vekstkurven for 3D svulst spheroids er også en konvensjonell tilnærming som karakteriserer langsiktige spheroid vekst virkemåten for forskjellige linjer. Spesielt, kan vi beskrive narkotika-respons ved å analysere svulst degradering eller svulst gjenvekst direkte gjenspeilet i vekstkurve. Derfor er kvantitativ vurdering av 3D svulst spheroids, inkludert størrelse og volum, å utle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av NSF gir IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (via-1640707), NIH tilskudd R21EY026380, R15EB019704 og R01EB025209 og Lehigh University oppstart fond.

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
  2. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  3. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  4. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  5. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  6. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  7. Tung, Y. -. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  8. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
  9. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  10. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  11. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
  12. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
  13. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  14. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  15. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348 (2015).
  16. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  17. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  18. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  19. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  20. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
  21. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846 (2016).
  22. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
  23. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
  24. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
  26. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  27. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  28. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  29. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412 (2014).
  30. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), (2016).
  31. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
  32. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
  33. Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical coherence tomography: technology and applications. , (2008).
  34. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171 (2011).
  35. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve – a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
  36. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
  37. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  38. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
  39. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
  40. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
  41. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. 암 연구학. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  42. Spalteholz, W. . Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , (1911).
  43. Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331 (2007).
  44. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
  45. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. . Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , 85710Z (2013).
  46. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
  47. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  48. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
  49. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  50. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
  51. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Tags

Keywords: 3D Tumor SpheroidsOptical Coherence Tomography3D Cell CultureAnti-cancer Drug DiscoveryCell SeedingCell SuspensionUltra-low Attachment PlateCentrifugationCell ConcentrationCell MonitoringIncubationMedium RefreshOCT System Construction
check_url/kr/59020?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image