JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
암 연구학

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af tre-dimensionelle Tumor Spheroids bruge optisk kohærens tomografi

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

Optisk kohærens tomografi (OCT), en tre-dimensionel tænkelig teknologi, blev brugt til at overvåge og karakterisere vækst kinetik af flercellede tumor spheroids. Præcise volumetriske kvantificering af tumor spheroids ved hjælp af en voxel tælle tilgang og etiket-fri dødt væv påvisning i spheroids baseret på iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast, blev demonstreret.

Abstract

Tumor spheroids er blevet udviklet som en tre-dimensionelle (3D) celle kultur model i kræft forskning og anti-cancer drug discovery. Men i øjeblikket, høj overførselshastighed imaging modaliteter udnytte lyse felt eller fluorescens detektion, er afskåret fra løse den samlede 3D-struktur af tumor klumpformet på grund af begrænset lys penetration, diffusion af fluorescerende farvestoffer og dybde-resolvability. For nylig, viste vores lab brugen af optisk kohærens tomografi (OCT), en etiket-fri og ikke-destruktiv 3D imaging modalitet for at udføre langsgående karakterisering af flercellede tumor spheroids i en 96-brønd plade. OCT var i stand til at opnå 3D morfologiske og fysiologiske oplysninger af tumor spheroids vokser op til ca. 600 µm i højden. I denne artikel viser vi en høj overførselshastighed OCT (HT-OCT) billedbehandlingssystem, der scanner hele multi godt pladen og henter 3D OCT data af tumor spheroids automatisk. Vi beskrive detaljerne i HT-okt system og byggeri retningslinjer i protokollen. Fra 3D OCT data, man kan visualisere den overordnede struktur af sfæroide med 3D afsmeltet og ortogonale skiver, karakteriserer den langsgående vækstkurve af tumor klumpformet baseret på de morfologiske oplysninger for størrelse og mængde, og overvåge vækst af regionerne døde celler i tumor klumpformet baseret på optiske iboende dæmpning kontrast. Vi viser, at HT-OLT kan bruges som en høj overførselshastighed imaging modalitet for stof screening samt kendetegner biofabricated prøver.

Introduction

Kræft er den næststørste årsag til dødsfald i verden1. Udvikle lægemidler rettet mod kræft er af afgørende betydning for patienter. Dog er det anslås at mere end 90% af nye anti-cancer medicin ikke i udviklingsfasen på grund af manglende effektivitet og uventede toksicitet i kliniske forsøg2. En del af grunden kan henføres til brugen af simple todimensionale (2D) celle kultur modeller for sammensatte screening, som giver resultater med begrænset prædiktive værdier af sammensatte effekt og toksicitet for de følgende faser af drug discovery2 , 3 , 4. seneste, tre-dimensionelle (3D) tumor klumpformet modeller har udviklet for at give klinisk relevante fysiologiske og farmakologiske data for anti-cancer drug discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Da disse spheroids kan efterligne væv-specifikke egenskaber af tumorer i vivo, som næringsstoffer og ilt kan gradient, hypoksiske kerne samt drug modstand19, brugen af disse modeller potentielt forkorte drug discovery tidslinjer, reducere udgifterne til investeringer, og bringe nye lægemidler til patienter mere effektivt. En kritisk tilgang til evaluering af sammensatte effekten i 3D tumor klumpformet udvikling er at overvåge klumpformet vækst og fornyet under behandlinger9,26. For at gøre dette, er kvantitative beskrivelser af tumor morfologi, dens diameter og mængde med høj opløsning billeddiagnostiske modaliteter, bydende nødvendigt.

Konventionelle billeddiagnostiske modaliteter, som lyse-felt, fase kontrast7,9,22,24og Fluorescens mikroskopi8,9,16, 18,22 kan give en måling af den sfæroide diameter, men kan ikke løse den overordnede struktur af klumpformet i 3D-rum. Mange faktorer bidrager til disse begrænsninger, herunder udbredelsen af den dybdeborende lys i klumpformet; Diffusion af de fluorescerende farvestoffer i klumpformet; udsender fluorescerende signaler fra spændte fluorescerende farvestoffer inde eller på den modsatte overflade af klumpformet på grund af stærk absorption og spredning; og dybde-resolvability af disse imaging modaliteter. Dette fører ofte til en unøjagtig volumen måling. Udvikling af nekrotisk kernen i spheroids efterligner nekrose i i vivo tumorer6,10,15,19,25. Denne patologiske funktion er usandsynligt gengivet i 2D celle kulturer19,25,27,28. Med en klumpformet størrelse større end 500 µm i diameter, en tre-lags koncentriske struktur, kan herunder et ydre lag af celler, et midterste lag af inaktiv celler og et nekrotisk kerne, observeres i klumpformet6,10 ,15,19,25, på grund af mangel på ilt og næringsstoffer. Levende og døde celle fluorescens imaging er standardmetoden til at mærke grænsen for de nekrotiske kerne. Dog igen, hindrer gennemføringer af både disse fluorescerende farvestoffer og synligt lys potentiale at sonde ind i nekrotisk kernen til at overvåge udviklingen i dens aktuelle form.

En alternativ 3D imaging modalitet, er optisk kohærens tomografi (OCT) indført for at karakterisere tumor spheroids. OCT er en biomedicinsk billedbehandling teknik, der er i stand til at erhverve etiket-fri, ikke-destruktiv 3D data fra op til 1-2 mm dybder i biologisk væv29,30,31,32,33 ,34. OLT anvender lav-sammenhæng interferometri at opdage back-spredt signaler fra forskellige dybder af prøven og giver rekonstruerede dybde-løst billeder på mikro-niveau rumlige resolutioner i sideretningen og lodret retning. OCT har været udbredt i oftalmologi35,36,37 og angiografi38,39. Tidligere undersøgelser har brugt OCT at observere morfologi af in vitro- tumor spheroids i basalmembranen matrix (f.eks.Matrigel) og evaluere deres svar til Fotodynamisk terapi40,41. For nylig, etableret vores gruppe en høj overførselshastighed OCT imaging platform til systematisk overvågning og kvantificere vækst kinetik af 3D tumor spheroids i multi godt plader42. Præcise volumetriske kvantificering af 3D tumor spheroids ved hjælp af en voxel tælle tilgang og etiket-fri nekrotisk væv påvisning i spheroids baseret på iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast blev demonstreret. Dette papir beskriver detaljerne i hvordan OCT imaging platform blev bygget og ansat til at opnå høj opløsning 3D billeder af tumor spheroids. De trinvise kvantitative analyser af vækst kinetik af 3D tumor spheroids, herunder præcise målinger af klumpformet diameter og mængder, er beskrevet. Også, metoden for ikke-destruktiv påvisning af nekrotisk væv områder ved hjælp af OLT, baseret på de iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast er præsenteret.

Protocol

1. forberedelse af celler Få cellelinjer fra en kvalificeret leverandør.Bemærk: Verificer, at celler fra cellelinjer interesse kan danne klumpformet i kultur medier eller ved hjælp af et substrat (basalmembranen matrix som Matrigel). Undersøge litteraturen9 eller udføre en runde af en pre eksperiment for en check. Optø frosne celler efter den særlige procedure cellelinie leverandøren. En generel procedure kan findes andetsteds43. K…

Representative Results

Høj overførselshastighed optisk kohærens tomografi billeddannelse af Spheroids i en 96-brønd plade Figur 3 udstiller resultatet af HT-okt scanning af en 96-brønd plade med HCT 116 tumor spheroids på dag 3. Den sekventielle scanning af hele pladen starter fra bunden-ret godt (H12). Figur 3B viser flowdiagram af software gennemførelsen af ordningen for HT-okt. Efter ?…

Discussion

Tumor aktivitet er særdeles relevante for dens morfologisk struktur. Lig overvågning karakteristiske vækstkurven for 2D cellekulturer, tracking vækstkurven for 3D tumor spheroids er også en konventionel tilgang til at karakterisere den langsigtede klumpformet vækst opførsel for forskellige cellelinjer. Især kan vi karakterisere drug svar ved at analysere tumor nedbrydning eller tumor genvækst direkte afspejles i vækstkurven. Derfor, kvantitativ vurdering af 3D tumor spheroids, herunder størrelse og volumen, at…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH tilskud R21EY026380, R15EB019704 og R01EB025209 og Lehigh University start fond.

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
  2. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  3. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  4. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  5. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  6. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  7. Tung, Y. -. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  8. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
  9. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  10. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  11. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
  12. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
  13. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  14. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  15. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348 (2015).
  16. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  17. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  18. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  19. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  20. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
  21. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846 (2016).
  22. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
  23. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
  24. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
  26. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  27. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  28. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  29. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412 (2014).
  30. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), (2016).
  31. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
  32. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
  33. Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical coherence tomography: technology and applications. , (2008).
  34. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171 (2011).
  35. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve – a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
  36. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
  37. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  38. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
  39. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
  40. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
  41. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. 암 연구학. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  42. Spalteholz, W. . Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , (1911).
  43. Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331 (2007).
  44. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
  45. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. . Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , 85710Z (2013).
  46. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
  47. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  48. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
  49. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  50. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
  51. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Tags

Keywords: 3D Tumor SpheroidsOptical Coherence Tomography3D Cell CultureAnti-cancer Drug DiscoveryCell SeedingCell SuspensionUltra-low Attachment PlateCentrifugationCell ConcentrationCell MonitoringIncubationMedium RefreshOCT System Construction
check_url/kr/59020?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image