מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing microbiota את הבטן של המעי הגס במבחנה, באמצעות סדרה של ריאקטורים שמדמות את התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול.
Abstract
Microbiota הבטן האנושית תפקיד חיוני בריאות האדם והן המחלה. למדתי את microbiota בטן באמצעות מודל ויוו , קשה בשל טבעה מורכבים, שיוך בתרבית של רכיבים מגוונים. המטרה של פרוטוקול זה היא תרבות של microbiota בטן במבחנה, המאפשר חקר הדינמיקה microbiota בטן, מבלי לשקול את התרומה של הסביבה שבה התרחשה יונקים. שימוש במבחנה טכנולוגיה culturing, התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול מדומה, כולל פרמטרים כגון pH, טמפרטורה, anaerobiosis, זמן העברה. פני המעי הגס מדומה על ידי הוספת מצופים mucin נשאים, יצירת שלב הרירית והוספת ממד נוסף. Microbiota הבטן הוא הציג על ידי מזריקים עם החומר צואה אנושית. על חיסון עם תערובת מורכבת זו של חיידקים, חיידקים מסוימים הם מועשרים את שונה האורך (בסדר עולה, רוחבי, יורד נקודתיים) סביבות (luminal והרירית) חציה של המודל במבחנה. זה חיוני לאפשר למערכת כדי להגיע למצב יציב, שבו הקהילה לבין מטבוליטים המיוצר נותרים יציבים. תוצאות הניסוי בכתב היד מדגימים איך הקהילה microbiota בטן חוסנו מתפתח בתוך קהילה יציבה לאורך זמן. ברגע מצב יציב מושגת, המערכת ניתן לנתח אינטראקציות חיידקי ופונקציות הקהילה או כדי לבדוק את ההשפעות של תוספים על microbiota הבטן, כגון מזון, רכיבי מזון או תרופות.
Introduction
Microbiota תחושת הבטן היא קהילה של מיקרו-אורגניזמים השוכנים מערכת העיכול (עוף). קהילה זו מגיע הריכוז המרבי במעי הגס, אשר מוערך להחזיק 10 חיידקים-1014 13, 500-1, 000 זנים, שחיים סימביוזה עם המעי הגס וחשש1,2. הרכב ואת הפונקציונליות של microbiota בטן שינוי במרחב לאורך הטמבל, ויוצרים אזור ספציפי הקהילות, עם המגוון ביותר נמצאו יש2,3,4,5. עבור כל אזור אנטומי, קהילות נפרדות מיקרוביאלי לשכון לומן, על שורות mucosal6. הקהילה לומן יש גישה ישירה יותר חומרים מזינים כאשר מצעים עוברים תא luminal7. למרות זאת, מתגוררים חיידקים מסוימים מעדיפים בשכבת ריר, ניצול mucin המיוצר על ידי תאי המעי הגס כמו5,81,מקור אנרגיה. ההבדל microenvironments בין השלבים luminal של הרירית גורמת לפיתוח קהילות מסוימות שלב התבדרות. . יחד, קהילות אלה מספקות פונקציות מטבוליות, כגון חילוף החומרים התזונתיים ואת הייצור של ויטמינים, ופונקציות חיסוניות, כגון מניעת הקולוניזציה של פתוגנים האנושי1,3, 9. microbiota הבטן גם פועלת באופן פונקציונלי ב נטיה עם תאי המעי הגס האנושי3.
כחלק חשוב של הטמבל אנושי, זה לא מפתיע כי microbiota הבטן ידועה לתרום שני מארח מחלה ובריאות מצב3,9,10,11,12. שינוי באוכלוסיית חיידקים במעיים שויכה מחלות אנושיות מרובות, כולל הפרעות לגית כמו מחלות מעי העיכול (מחלת המעי הדלקתי), תסמונת המעי המעי (IBS), אך גם מחלות אחרות כגון השמנת יתר, מחלות הדם אוטיזם 3 , 9 , 10 , 11 , 12. מטבוליטים המופק microbiota הבטן יש השפעה גלובלית, להגיע במקומות מרוחקים12,הבטן13. לדוגמה, הציר בטן-מוח מזוהה עם הפרעות נפשיות כמו חרדה ודיכאון14. לכן, לומד microbiota על הבטן חשובה שדות מרובים של מחקר, החלים על מחלות רבות, אפילו אלה קשורה לא לעיתים קרובות עם הטמבל.
אמנם זה נרחב הוא הודה כי לימוד microbiota את הבטן חשוב, היא מאמץ מורכב. מודלים בעלי חיים מרובים זמינים, של חיות קטנות כמו דג זברה, חולדות ועכברים, גדולים כמו קופים וחזירים15-19. עם זאת, היישום של החיות האלה במונחים microbiota בטן האדם הוא לא פשוטה, שכן החיות האלה יש ייחודי חיידקי קהילה אשר התפתח בהתבסס על הסביבה ותזונה, הם נבדלים מבחינה אנטומית בני20 , 21. השימוש של ניסויים מסיר את השאלה של רלוונטיות אך מציג קבוצה נוספת של אתגרים. מחקרים בבני אדם יקר, זמן רב, והם מבחינה אתית מאולצות11. יתר על כן, גורמים מבלבלים להשפיע microbiota את הבטן מחקרים בבני אדם, כולל גיל או שלב התפתחותי, הסביבה, תזונה, תרופות של גורמים גנטיים2,4,22. ישנם גם הגבלות על מה יכול להיבדק אצל בני אדם, ועל איזה סוג של דגימות ניתן לקצור במה פי4.
חיסרון קריטי אחד של באמצעות מערכת ויוו ללמוד את microbiota הבטן היא הנוכחות של רכיבים יונקים. בטן microbiota של תאים אנושיים לתקשר אחד עם השני, ויוו הגדרת, זה בלתי אפשרי להבדיל בין השניים. מטבוליטים המיוצר על ידי microbiota הבטן נלקחים על ידי תאי המעי הגס, כך מדידות אין אפשרות לחשב בדייקנות. לכן, בכל מחקר מכניסטית חייב להיות מוגבל ל- מדדים מובילים11. חיסרון גדול נוסף ללימודי אין ויוו הוא חוסר היכולת הקציר דגימות מאזורים שונים של הטמבל longitudinally23. זה אינו מאפשר ההערכה של שינויים עלולה להתרחש microenvironments של המעי הגס לאורך זמן12. אין ויוו מחקרים רבים, כולל מחקרים בבני אדם, מסתמכים על ניתוח של דגימות צואה כדי לזהות שינויים בטן microbiota12. אמנם זה אינפורמטיבי, הוא אינו מספק נתונים על microbiota הבטן מעבר הטמבל, אינו מבדיל בין7,86,5,luminal ובקהילות הרירית.
עבור microbiota הבטן, היישום של שיטת במבחנה נדרש ללמוד את הדינמיקה של הקהילה חיידקי, ללא התערבות של הרכיבים יונקים. באמצעות שיטת במבחנה מאפשר עבור הפקד חזק של תנאים סביבתיים10, בדיקה של פרמטרים מרובים בו זמנית, את היכולת לטעום longitudinally, בנפחים גדולים11. מאז שיטת הפריה מנצל מכנית, לא מארח, אין שיקולים נדרשים עבור גיל, הסביבה, דיאטה או הרקע הגנטי. מערכות אלה ניתן להשתמש כדי לבדוק גם בטן שלמה microbiota לקהילה, נבחרו רק אורגניזמים, או אפילו יחיד זנים. חשוב לציין, התוצאות במבחנה לשחזור, עדיין שומרים על רמה של גיוון להשוות מחקרים ויוו11,22.
בהתאם את ההשערה המדובר את התוצאות הרצויות, אני לימודיחוץ גופית n יכול להתבצע במספר דרכים. הם יכולים לנצל שיטות פשוטות, כגון המקננת דגימות עם צואה homogenate24 או ביצוע אצווה אחת התרבויות במשך 24-48 שעות25ומערכות כלי יחיד. הם יכולים גם להתבצע באמצעות כלי יחיד מערכות ושיטות מורכבים יותר, כגון באמצעות מערכת chemostat לייצר קהילה מיקרוביאלית של הבטן יציבה11. עם זאת, השימוש של כור יחיד יכול יתר לפשט microbiota12 מאחר והוא רק מייצג מקטע אחד של המעי הגס, אף-על-פי המעי הגס מורכב של האזורים עולה, רוחבי, יורד.
על מנת ללמוד את הקהילה microbiota בטן שמתפתח באזורים שונים של המעי הגס (בסדר עולה, רוחבי, יורד האזורים), יכול להיות מועסק מערכת מורכבת, רב שלבית. במערכות אלו, הוגדרו מספר כלי כדי לחקות את האזורים השונים של המעי הגס, כך microbiota הבטן של האזורים עולה, רוחבי, יורד מעובדות באופן עצמאי. כלים אלה מחוברים, באמצעות משאבות לזוז סובסטרטים ברצף, מסדר עולה כדי רוחבי לאזורים המעי הגס היורד, מחקה את הזרימה של חומרים מזינים דרך הטמבל.
מטרת מחקר זה היתה כדי להדגים כיצד מערכת תרבות במבחנה 5 שלבים (ראה טבלה של חומרים) ניתן להשתמש כדי לטפח את הקהילה microbiota בטן, וכדי להדגים הקהילה dynamics מבחינת יציבות הרכב. במערכת זו, לכלי אחד מייצג את הבטן, אחד מייצג את המעי הדק. המעי הגס מחולק לשלושה אזורים (בסדר עולה, רוחבי, יורד), לכלי אחד המייצג את כל אזור26. הגדרת הניסוי הזה, שתי מערכות מלאה היו לפעול במקביל, עם יחידה 1 המכיל mucin נשאים כדי מייצג את השטח הרירית, יחידה 2 המכיל אין נושאות mucin. הקהילות שהתפתח בשלבים luminal, הרירית של כל אזור הושוו אחד לשני, וכדי את inoculum צואה לאורך זמן באמצעות מטוסי אף-16 rRNA ג’ין רצף וניתוח SCFA. התוצאות שהוצגו מדגימים את הסוג של הקהילה, הן מבחינת קומפוזיציה ופונקציונליות, אשר ניתן להפיק במבחנה מערכת מסוג זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכות culturing in vitro פותחו כדי ללמוד את microbiota הבטן של המעי הגס. הם משתמשים שההדרכה נועד לדמות את התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול, לקדם את הצמיחה של קהילה מיקרוביאלית מעיים בוגרת לכל אזור של המעי הגס33. בעוד המושג לוגי ומובן, הניהול בפועל של מערכות culturing in vitro ללמוד את microbiota הבטן דו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מיס אודרי תומאס-Gahring הוא הודה לה GC/MS לפעול. כן נרצה להודות מאסימו Marzorati לעריכת כתב היד.
Materials
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
References
- Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
- Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
- Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
- Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
- McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
- Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
- Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
- Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
- Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
- McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
- Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
- Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
- Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
- Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
- Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
- Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
- Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
- Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
- Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
- Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
- Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
- Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
- Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
- Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
- Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
- Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).
- Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
- Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
- Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
- Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
- Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).
