Visualisation fluorescente de l'ARN étiqueté mangue dans les gels de polyacrylamide par l'intermédiaire d'une méthode de coloration
Summary
Ici, nous présentons une méthode sensible, rapide et discriminante de coloration post-gel pour imager les ARN marqués avec des aptamers de mangue d’ARN I, II, III, ou IV, utilisant des gels indigènes ou dénaturants de gel de polyacrylamide (PAGE). Après avoir utilisé des gels PAGE standard, l’ARN étiqueté mangue peut être facilement taché de TO1-Biotine, puis analysé à l’aide de lecteurs de fluorescence couramment disponibles.
Abstract
Les gels polyacrylamides indigènes et dénaturants sont couramment utilisés pour caractériser la mobilité complexe de ribonucleoprotein (RNP) et pour mesurer la taille de l’ARN, respectivement. Comme de nombreuses techniques d’imagerie par gel utilisent des taches non spécifiques ou des sondes de fluorophore coûteuses, des méthodologies sensibles, discriminatoires et économiques d’imagerie par gel sont hautement souhaitables. Les séquences de noyau de mangue d’ARN sont de petits motifs de séquence (19-22 nt) qui, une fois fermés par une tige arbitraire d’ARN, peuvent être simplement et peu coûteux annexés à un ARN d’intérêt. Ces étiquettes de mangue se lient avec une forte affinité et spécificité à un ligand fluorophore thiazole-orange appelé TO1-Biotine, qui devient des milliers de fois plus fluorescent lors de la liaison. Ici, nous montrons que la mangue I, II, III, et IV peut être utilisé pour imager spécifiquement l’ARN dans les gels à haute sensibilité. Aussi peu que 62,5 fmol d’ARN dans les gels indigènes et 125 fmol d’ARN dans les gels dénaturants peuvent être détectés par des gels de trempage dans un tampon d’imagerie contenant du potassium et 20 nM TO1-Biotine pendant 30 min. Nous démontrons la spécificité du système Mango-étiqueté par l’imagerie d’un ARN bactérien 6S marqué par Mango dans le contexte d’un mélange complexe de l’ARN bactérien total.
Introduction
La mangue est un système de marquage à ARN composé d’un ensemble de quatre petits aptamers à ARN fluorescents qui se lient étroitement (liaison nanomolaire) à de simples dérivés du thiazole-orange (TO1-Biotine, Figure 1A)1,2,3 . Lors de la liaison, la fluorescence de ce ligand est multipliée par 1 000 à 4 000 selon l’aptamer spécifique. La haute luminosité du système Mango, qui pour Mango III dépasse celle de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), combinée avec l’affinité de liaison nanomolaire des aptamers de mango d’ARN, lui permet d’être employé dans l’imagerie et la purification de l’ARN complexes2,4.
Les structures de rayons X de Mango I5, II6, et III7 ont été déterminées à haute résolution, et les trois aptamers utilisent un quadruplex d’ARN pour lier TO1-Biotine (Figure 1B– D). Les noyaux compacts des trois aptamères sont isolés de la séquence externe de l’ARN par des motifs d’adaptateur compacts. Mango I et II utilisent tous deux un adaptateur flexible de boucle gNRA-like pour relier leurs cœurs de mangue à un duplex arbitraire d’ARN (figure 1B,C). En revanche, Mango III utilise un motif triplex rigide pour connecter son noyau à une hélice arbitraire de l’ARN (Figure 1D, résidus violets), alors que la structure de Mango IV n’est pas actuellement connue. Comme le noyau liant ligand de chacun de ces aptamères est séparé de la séquence externe de l’ARN par ces adaptateurs hélicoïdaux, il semble probable qu’ils puissent tous être simplement incorporés dans une variété d’ARN. L’ARN régulateur bactérien 6S (Mango I), les composants de la levure spliceosome (Mango I), et l’homme 5S ARN, U6 ARN, et un C / D scaRNA (Mango II et IV) ont tous été marqués avec succès de cette façon2,8, ce qui suggère que de nombreux les ARN biologiques peuvent être étiquetés à l’aide du système d’aptamer DE mango d’ARN.
Les gels dénaturants et indigènes sont couramment utilisés pour étudier les ARN. Les gels dénaturants sont souvent utilisés pour juger de la taille de l’ARN ou du traitement de l’ARN, mais généralement, dans le cas d’une tache nordique, par exemple, nécessitent plusieurs étapes lentes et séquentielles afin de générer une image. Alors que d’autres aptamers fluorogènes d’ARN, tels quel’épinard d’ARN et le brocoli, ont été employés avec succès pour l’imagerie de gel 9, aucun système fluorogenic d’aptamer à ce jour possède la luminosité élevée et l’affinité du système de mangue, le faisant d’un intérêt considérable d’étudier les capacités d’imagerie par gel de Mango. Dans cette étude, nous nous sommes demandé si le système de mango d’ARN pourrait être simplement étendu à l’imagerie de gel, car les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de TO1-Biotine (510 nm et 535 nm, respectivement) sont appropriées pour l’imagerie dans le canal d’eGFP commun à la plupart fluorescent instrumentation de balayage de gel.
Le protocole de coloration post-gel présenté ici fournit un moyen rapide de détecter spécifiquement les molécules d’ARN étiquetées mango dans les gels d’électrophorèse de gel polyacrylamide (PAGE) indigènes et dénaturants. Cette méthode de coloration consiste à tremper les gels dans un tampon contenant du potassium et de la TO1-Biotine. Les aptamers de mangue d’ARN sont g-quadruplex basés et le potassium est exigé pour stabiliser de telles structures. À l’aide de l’ARN transcrit à partir de modèles d’ADN minimaux encodants par Mango (voir la section du protocole), nous pouvons simplement détecter aussi peu que 62,5 fmol d’ARN dans les gels indigènes et 125 fmol d’ARN dans les gels dénaturants, en utilisant un protocole de coloration simple. Contrairement aux taches d’acide nucléique non spécifiques courantes (voir Tableau des matériaux, référence à SG à partir de là), nous pouvons clairement identifier l’ARN marqué par mango, même lorsque des concentrations élevées d’ARN total non étiqueté sont présents dans l’échantillon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un avantage significatif de l’étiquette fluorescente Mango est qu’une seule étiquette peut être utilisée de plusieurs façons. La luminosité élevée et l’affinité de ces aptamers les rendent utiles non seulement pour la visualisation cellulaire 2, mais aussi pour l’ARN in vitro ou la purification RNP4. Par conséquent, l’imagerie gel étend la polyvalence de l’étiquette Mango d’une manière simple. La sensibilité d’imagerie de gel de mangue est légèrement inféri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Razvan Cojocaru et Amir Abdolahzadeh pour leur assistance technique et Lena Dolgosheina pour la relecture du manuscrit. Une subvention de fonctionnement du Conseil canadien de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) a été accordée à P.J.U. pour ce projet.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
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