Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de bouw van een cel cultuur kamer ontworpen om bloot cellen tot verschillende soorten elektrische stimulatie, en het gebruik ervan bij de behandeling van mesenchymale stamcellen om osteogenic differentiatie.
Abstract
Mesenchymale stamcellen/stromale cellen (MSCs) zijn uitvoerig gebruikt om bot genezing in weefsel engineering benaderingen te bevorderen. Elektrische stimulatie (EStim) heeft aangetoond dat MSC osteogenic differentiatie in vitro verbeteren en bot genezing in klinische instellingen te bevorderen. Hier beschrijven we de bouw van een EStim kamer voor de cultuur van de cel en het gebruik ervan bij de behandeling van bot-merg-afgeleide MSC ter verbetering van osteogenic differentiatie rat. We vonden dat behandeling van MSCs met EStim voor 7 dagen in een aanzienlijke toename van de osteogenic differentiatie resulteert, en bovenal dit pro-osteogenic effect blijft voortbestaan lang na (7 dagen) EStim wordt stopgezet. Deze aanpak van voorbehandeling MSCs met EStim ter verbetering van osteogenic differentiatie kan worden gebruikt om botweefsel engineering behandeling resultaten te optimaliseren en, dus, helpen hen om hun volledige therapeutische potentieel te bereiken. Naast deze applicatie, kunnen deze EStim cel cultuur kamer en protocol ook worden gebruikt te onderzoeken van andere EStim-gevoelige cel gedrag, zoals migratie, proliferatie, apoptosis en steiger bijlage.
Introduction
Een toename van de trauma’s en/of ziekte-geïnduceerde bot gebreken worden behandeld met behulp van verschillende combinaties van celtherapie en regeneratieve geneeskunde technologieën. MSCs zijn de cel van keuze in dergelijke behandelingen, vanwege hun relatief hoge osteogenic activiteit, isolatie en uitbreiding efficiëntie en veiligheid1. Wilt maximaliseren van hun osteogenic activiteit en, dus, het optimaliseren van hun therapeutische doeltreffendheid, zijn verschillende methoden om te manipuleren MSCs voorafgaand aan het gebruik ervan in deze behandelingen (zoals herzien door Mauney et al.2) bijgekomen. Een dergelijke methode is EStim, waarvan is aangetoond te verbeteren van MSC osteogenic differentiatie in vitro3 en bot in vivo4genezing te bevorderen. Ondanks het groeiend aantal studies gericht op de behandeling van MSCs met EStim, moet een optimale regime voor het maximaliseren van de EStim pro-osteogenic effect nog worden gedefinieerd.
Andere methoden in vitro met behulp van EStim gebruiken zout bruggen ondergedompeld in het kweekmedium, die cellen van metalen elektroden5scheidt. Het voordeel hiervan is dat de invoering van chemische bijproducten (bijvoorbeeld, corrosie van metalen elektroden) die mogelijk cytotoxisch EStim leveren door middel van zout bruggen elimineert. Ondanks dit voordeel, zout bruggen zijn omslachtig om mee te werken en de EStim zij leveren verschilt van die in geleverde in vivo modellen, waardoor het moeilijk te correleren van resultaten bij het gebruik van de twee systemen. Opstellingen die EStim via metalen of koolstof elektrodes vast binnen de cel cultuur putten leveren simuleren (zoals herzien door Hronik-Tupaj en Kaplan6) beter apparaten die worden gebruikt in vivo; echter, deze apparaten zijn moeilijk te reinigen/steriliseren tussen toepassingen en het aantal cellen die kunnen worden bestudeerd per experiment is beperkt. We ontwierpen de EStim zaal gepresenteerd hier specifiek om aan te pakken van de beperkingen van deze andere opstellingen. Terwijl de meeste van onze ervaring met behulp van deze zaal EStim geweest met 2D en 3D culturen met het beenmerg – en adipeus-weefsel-afgeleide MSCs3,4, een belangrijk voordeel van dit Parlement is dat het is veelzijdig en, met relatief kleine wijzigingen, kunnen worden aangepast aan het bestuderen van andere celtypes onder allerlei verschillende omstandigheden.
Hier beschrijven we de bouw van een EStim vergaderzaal voor de cultuur van de cel; vervolgens tonen wij het gebruik ervan door behandelende MSCs met verschillende regimes van EStim en het meten van het resulterende effect op osteogenic differentiatie. MSC osteogenic differentiatie wordt beoordeeld via afzetting van calcium, alkalisch fosfatase activiteit en osteogenic marker genexpressie. Nog belangrijker is, in verleden experimenten waarmee deze opstelling, we hebben vastgesteld dat deze pro-osteogenic effecten aanhouden lang nadat de EStim behandeling werd gestaakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we de bouw van een kamer en een methode voor de behandeling van mesenchymale stamcellen met EStim die tot verbeterde osteogenic differentiatie leidt.
De setup van de EStim gepresenteerd vereist geen speciale apparatuur/kennis en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de biologie/biochemie de cel van de stam van de standaard door junioronderzoekers. Echter wanneer gebouw en met behulp van de zaal EStim, moet speciale zorg men in een paar kritische stappen. Bij de behande…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een AO Stichting Start-Up Grant (S-14-03 H) en de Friedrichsheim-Stichting (Stiftung Friedrichsheim), gevestigd in Frankfurt am Main, Duitsland.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?. Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k’o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
