Secondo i saggi foglia distaccati per semplificare gli studi sull'espressione genica nelle patate durante l'infestazione da mawing Insect Manduca sexta
Summary
Il metodo presentato crea tessuto vegetale naturale danneggiato erbivoro attraverso l’applicazione di larve di sexta Manduca a foglie staccate di patate. Il tessuto vegetale è stato analisi per l’espressione di sei omologhi del fattore di trascrizione coinvolti nelle prime risposte all’erbivoro degli insetti.
Abstract
La natura multitrofica degli studi sull’espressione genica degli insetti erbivori richiede un gran numero di repliche biologiche, creando la necessità di protocolli erbivori più semplici e più snelli. Le perturbazioni degli insetti masticatori sono di solito studiate in sistemi vegetali interi. Mentre questa strategia dell’intero organismo è popolare, non è necessario se osservazioni simili possono essere replicate in un’unica foglia staccata. L’ipotesi è che gli elementi di base necessari per la trasduzione del segnale siano presenti all’interno della foglia stessa. Nel caso di eventi iniziali nella trasduzione del segnale, le cellule devono solo ricevere il segnale dalla perturbazione e trasmettere quel segnale alle cellule vicine che vengono analizzate per l’espressione genica.
Il metodo proposto modifica semplicemente la tempistica del distacco. Negli esperimenti su piante intere, le larve sono confinate in una singola foglia che alla fine viene staccata dalla pianta e analizzata per l’espressione genica. Se l’ordine di escissione è invertito, dall’ultimo negli studi di piante intere, al primo nello studio distaccato, l’esperimento di alimentazione è semplificato.
Kennebec, Var, Varnebec di Solanum viene propagato dal trasferimento nodale in un semplice mezzo di coltura dei tessuti e trasferito al suolo per un’ulteriore crescita, se lo si desidera. Le foglie vengono ascise dalla pianta madre e trasferite ai piatti Petri dove il saggio di alimentazione viene condotto con gli stadi larvali di M. sexta. Il tessuto fogliare danneggiato viene analizzato per l’espressione di eventi relativamente precoce nella trasduzione del segnale. L’analisi dell’espressione genica ha identificato i fattori di trascrizione Cys2-His2-His2 (C2H2) specifici per l’infestazione, confermando il successo dell’uso di foglie distaccate negli studi di risposta precoce. Il metodo è più facile da eseguire rispetto alle infestazioni di piante intere e utilizza meno spazio.
Introduction
Herbivory mette in moto una serie di eventi molecolari durante i quali una pianta può sia identificare l’attacco che montare una risposta appropriata per la sua sopravvivenza. Una pianta riceve due segnali di base da insetti masticatori; uno dal danno fisico al tessuto e l’altro da sostanze specifiche per insetti. I modelli molecolari associati ai danni (DAMP) vengono rilasciati in risposta ai danni creati dalle parti della bocca larvale e innescano una risposta ben definita della ferita che si traduce in un aumento dell’acido jasmonico ormonale e nella trascrizione dei geni di difesa1. Uno dei DAMP più conosciuti è systemin, un polipeptide che è formato dalla scissione della proteina prosystemin più grande dopo una foglia viene ferita2,3. La risposta della ferita da acido jasmonico è ulteriormente modulata da modelli molecolari associati agli erbivori (HAMP), che possono essere derivati dalla saliva del bruco, dal contenuto intestinale (rigurgitante) e dalle feci (frass)4. Gli insetti usano queste sostanze per aumentare o eludere la risposta alla difesa5. I fattori di trascrizione trasmettono quindi il messaggio dai segnali ormonali nella risposta della difesa attraverso la regolazione dei geni di difesa a valle6,7,8.
Alcuni studi di interazione pianta-insetto utilizzati in ambienti di laboratorio sono di tipo simulato, con l’obiettivo di approssimare il metodo naturale di alimentazione da parte dell’insetto. L’erbivoro simulato è di solito realizzato creando danni artificiali ai tessuti vegetali con vari strumenti che imitano il meccanismo specifico delle parti della bocca degli insetti sufficiente a causare il rilascio di DAMP e innescare la produzione di geni di difesa. Altri componenti specifici degli insetti come secrezioni orali o rigurgitti vengono spesso aggiunti per replicare il contributo degli HAMP9,10,11. La creazione di una dimensione e di un tipo specifico di ferita e l’applicazione di quantità precise di HAMP è uno dei vantaggi di questi tipi di studi e può offrire risultati più riproducibili. Gli studi naturali sull’erbivoro, in cui i danni al tessuto vegetale sono compiuti mediante l’applicazione di insetti acquisiti sul campo o allevati in laboratorio, sono spesso più impegnativi perché le quantità di ferita e HAMP sono regolate dal comportamento degli insetti e aggiungono variabilità al dati. I metodi naturali rispetto a quelli simulati e i loro vantaggi e svantaggi sono ben dibattuti nella letteratura12,13,14.
Per studiare gli eventi di segnalazione precoce come i fattori di trascrizione, una certa percentuale della foglia deve essere consumata in un lasso di tempo relativamente breve, quindi le larve devono iniziare a masticare immediatamente e mantenere il consumo fino a quando la foglia non viene congelata per l’analisi. M. sexta è un alimentatore vorace su più piante solanacee durante molte delle sue fasi larve, rendendolo ideale per impartire il massimo danno in un tempo relativamente breve15. Ciò è utile quando si studiano i primi eventi di segnalazione, poiché la risposta della pianta si verifica quasi immediatamente dopo che un insetto contatta la superficie fogliare16,17. Il metodo di contenimento delle gabbie a clip comunemente usato si dimostra goffo, in quanto più gabbie richiederebbero continui aggiustamenti durante l’esperimento per consentire la rimozione o l’aggiunta di larve. Le foglie devono anche essere abbastanza grandi e forti da sostenere l’alimentazione di più insetti contemporaneamente. Questi tipi di piante di patate richiedono una grande quantità di spazio per osservare l’alimentazione. Le larve spesso si spostano nella parte inferiore della superficie della foglia, il che rende anche le osservazioni di alimentazione piuttosto difficili. L’uso di piante intere per eseguire questi esperimenti è chiaramente ingombrante.
Lo studio attuale utilizza foglie staccate isolate nei piatti Petri piuttosto che intere piante per snellire e semplificare l’intero approccio vegetale allo studio dell’erbivoro. L’applicazione del protocollo in questo studio è limitata all’osservazione di un gruppo di fattori di trascrizione C2H2 indotti precocemente nelle foglie di patate dopo danni erbivori da parte delle larve di M. sexta.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso di metodologie erbiflue vegetali intere esistenti non è necessario per raggiungere l’obiettivo di questo particolare studio (ad esempio, vagliare una serie di geni candidati per la loro risposta all’infestazione). L’ovvio vantaggio della raffinatezza delle foglie staccate è l’accorciamento del tempo necessario per eseguire i saggi erbivori. La natura ingombrante di intere piante con gabbie clip viene eliminata e i saggi vengono eseguiti prima, poiché le piante fino a 2 settimane possono essere utilizzate per rac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Bob Farrar e Alexis Park per aver fornito insetti utilizzati in questo studio e per la loro esperienza nella messa in scena larvale. Ulteriori grazie a Michael Blackburn e Saikat Ghosh per la revisione critica del manoscritto.
La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha lo scopo esclusivamente di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni o approvazioni da parte del Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti.
USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
