Vann fordelingen fra Xylem i Woody Plants

Summary

Observere vann fordelingen i xylem gir betydelig informasjon om vannstrømmen dynamikk i Woody planter. I denne studien viser vi den praktiske tilnærmingen til å observere vannfordeling i xylem ved hjelp av en kryostaten og en fryse-SEM, som eliminerer artifactual endringer i vann statusen under prøve forberedelsen.

Abstract

Et skanner elektronmikroskop som er installert på fryse enheten (Frys-SEM) gjør det mulig å observere prøven ved Subzero temperaturer og har blitt brukt til å utforske vannfordeling i plante vev i kombinasjon med fryse fiksering teknikker ved hjelp av flytende nitrogen (LN ₂). for Woody arter, men forberedelser for å observere xylem tverrgående-cut overflaten innebære noen vanskeligheter på grunn av retningen av tre fibre. I tillegg kan høyere spenning i vannsøylen i xylem-kanaler av og til forårsake artifactual endringer i vann fordelingen, spesielt under prøve fiksering og-oppsamling. I denne studien, viser vi en effektiv prosedyre for å observere vann fordelingen i xylem av Woody planter in situ ved hjelp av en kryostaten og fryse-SEM. Ved første, under prøvetaking samling, måle xylem vann potensialet bør avgjøre om høy spenning er til stede i xylem rør. Når vann potensialet i xylem er lavt (< ca. − 0,5 MPa), er det nødvendig med en spennings hvile prosedyre for å tilrettelegge for bedre bevaring av vann statusen i xylem-rør under prøve fryse fiksering. Deretter festes en vanntett krage rundt trestammen og fylles med LN₂ for fryse fiksering av vann statusen til xylem. Etter høsting, forsiktighet bør utvises for å sikre at prøven er bevart frosset mens fullføre prosedyrene for prøven forberedelse til observasjon. En kryostaten er ansatt for å tydelig avdekke xylem tverrgående overflate. I Freeze-SEM observasjoner, tid justering for fryse-etsing er nødvendig for å fjerne frost støv og fremheve kanten av celleveggene på visningsflaten. Våre resultater viser anvendelsen av fryse-SEM teknikker for observasjon av vann distribusjon innen xylem på mobilnettet og subcellulære nivåer. Kombinasjonen av fryse-SEM med ikke-ødeleggende in situ observasjon teknikker vil dypt forbedre utforskningen av Woody plante vannstrømmen dynamikk.

Introduction

Tilgjengelighet av vannressurser (dvs. nedbør, jord vanninnhold) avgjør strengt dødelighet og Geografisk fordeling av plantearter, siden de trenger å absorbere vann fra jorda og transportere den til bladene for fotosyntetiske produksjon. Planter må opprettholde sitt vann transport system under varierende vannforsyninger. Spesielt, Woody planter generere høye spenninger i sine kanaler langs transpirasjon bekker som, i noen tilfeller, de trenger for å holde sin krone mer enn ~ 100 m over bakken. For å opprettholde vannsøyler under så høyt negativt trykk, består xylem-kanalene av et kontinuum av rørformede celler med stive og hydrofobe lignified celle vegger¹. Sårbarheten for å xylem dysfunksjon av xylem-kanaler i hver art er en god avgjørende faktor for arten overlevelse under varierende vannforsyning². I tillegg studere vann status xylem energibærere er viktig for evalueringen av helsetilstanden til enkelte trær utsatt for abiotiske eller biotiske påkjenninger. Måler SAP flyte eller vann muligheter kanne skaffe anslår av en Woody plante ‘ vann rang på grunn av det integrert hydraulisk funksjonen av xylem rør. Videre kan visualisering av vann fordelingen i xylem-cellene avklare tilstanden til de enkelte komponentene i hydraulikksystemet i xylem.

Flere teknikker for å visualisere vannet status for xylem energibærere finnes³. Den klassiske og nyttige metoder for å observere vann trasé i Woody vev innebære farging av vannsøylen ved å senke endene av kuttet grener i et fargestoff eller ved å injisere et fargestoff i stående trestammer⁴. Soft x-ray Photography også tillater visualisering av vann distribusjon av skiver av tre plater på grunn av differensial X-ray absorpsjon intensiteten av fuktigheten i xylem^5,6. Disse metodene, men bare gi spor av vann bevegelse eller demonstrere makroskopisk distribusjoner av vann. Nylig, ikke-destruktive observasjons teknikker, slik som Micro Focus X-ray beregnet tomografi (benvolum)^7,8,9,10og magnetisk resonans imaging (MRI)^{11, 12}, har blitt betydelig forbedret for å tillate observasjon av vann i xylem-kanaler innenfor intakt saplings. Disse ikke-destruktive metoder har store fordeler i at vi kan observere xylem ‘ s vann status uten kunstige skjære effekter, og vi kan spore vannstrømmen dynamikk ved sekvensiell Imaging eller innføre en kontrast agent¹⁰. Men vi trenger å bruke en tilpasset MRI for anlegget Imaging eller et spesialisert anlegg for Synchrotron-baserte Benvolum for å få bilder som kan identifisere cellulære nivå vanninnhold. I tillegg, selv om den Synchrotron-baserte benvolum system aktivert for å oppnå fine bilder med høy romlig oppløsning, som kan sammenlignes med lys mikroskopi^7,8,9, kan levende celler bli skadet av stråling av høy energi X-ray^13,14. Ansette en skanning elektronmikroskop der fryse-enheter er installert (fryse-SEM) er en svært nyttig metode for nøyaktig lokalisering av vann i xylem på cellenivå, selv om dette krever ødeleggende måte høsting prøven for observasjon. For å fikse vannet i xylem-kanaler, er en del av stilkene (dvs. kvister, grener eller stengler) frosset in situ av flytende nitrogen (LN₂). Observasjoner av overflaten av trimmet, frosne eksemplarer av fryse-SEM gir svært forstørret bilder av xylem strukturen som vi kan identifisere vannet i xylem energibærere som is. En betydelig begrensning av denne metoden er at sekvensiell observasjon av vann bevegelighet innenfor samme prøve er umulig. Imidlertid er anvendelsen av Benvolum eller MRI for sekvensiell observasjon av trær som bor i et felt ekstremt utfordrende fordi disse instrumentene ikke er bærbare. I kontrast, har fryse-SEM et potensial for å bruke denne teknikken på store trær i feltet eksperimenter for å tydelig visualisere vanninnholdet på ikke bare cellenivå, men også på et finere struktur nivå, for eksempel vann i intervascular groper¹⁵, vann i intercellulære mellomrom¹⁶, eller bobler i vann kolonne¹⁷.

Mange studier observere xylem Water av fryse-SEM har blitt rapportert ^5,12,^{18,19,20,21,23}. Utsumi et al. (1996) etablerte først protokollen for observasjon av xylem in situ ved å fryse-fiksering av en levende stamme via fylling LN₂ inn i en beholder satt på stammen²¹. Temperaturen på prøven ble opprettholdt under-20 ° c under prøvetaking og under fryse-SEM forberedelse for å unngå å smelte isen i xylem-kanaler. Denne metoden har blitt brukt til å observere vannet i xylem for å klargjøre vann fordelingen under skiftende vannregime¹¹,¹²,^24,25,^{26, 27,28}, den sesongmessige variasjonen av vann distribusjon²¹,^29,30, effekten av fryse-tine sykluser^{17,31, 32}, fordelingen av vann i vått tre⁵, endringer i vann fordelingen under overgangen fra yteved til kjerne ved²⁰, sesongmessige tid løpet av cambial aktivitet og differensiering av fartøy³³, og kavitasjon indusert av visse biotiske spenninger^23,34. Hydrauliske ledningsevne og rør sårbarhet for kavitasjon har også blitt verifisert ved hjelp av fryse-SEM^35,36. Den er utstyrt med energi dispersive X-ray-massespektrometri (EDX eller EDS) som har blitt brukt til å studere element fordeling over overflaten av en prøve som inneholder vann³⁷.

Freeze-fiksering av en levende stamme som inneholder rør under høy hydraulisk spenning noen ganger fører til kunstige kavitasjoner som er observert av Frys-SEM som brukket iskrystaller i lumen av energibærere^38,39. Spesielt er løvtrær arter med lengre og bredere energibærere sårbare for spennings induserte artefakter, slik som kavitasjon forårsaket av prøve kutting, selv om det ble utført under vann^3,40. Kavitasjon artefakter blir iøynefallende etter prøvetaking av et transpiring tre (dvs. prøvetaking i løpet av dagtid) eller under alvorlige tørke forhold, og de kan villede til en overvurdering av kavitasjon forekomst^3,38, i ³⁹. Derfor må spenningen som arbeider i energi rør frigis for å unngå artifactual kavitasjon^3,12,39.

Den fryse-brudd teknikk ved hjelp av en kniv installert i et prøve kammer er ofte brukt for å avdekke prøveoverflaten for Freeze-SEM observasjon. Men fryse-brukket flyene av Woody plante vev, spesielt tverrgående deler av sekundær xylem, er for grovt til å tydelig observere Anatomiske egenskaper og vann i vevet⁶. Anvendelsen av en kryostaten for trimming av en prøve tillater rask og høy kvalitet utarbeidelse av prøve overflater^20,23. Det overordnede målet med denne metoden er å gi bevis med elektron mikroskopi oppløsning av vann fordelingen i ulike typer xylem-celler in situ uten forekomst av prøvetaking gjenstander. Vi introduserer vår oppdaterte prosedyre, som har blitt stadig bedre siden vi først vedtok det, om prøvetaking, trimming og rengjøring av prøveoverflaten for å oppnå høy kvalitet elektron micrographs av fryse-faste prøver av xylem.

Protocol

Merk: et skjematisk diagram av denne protokollen er vist i figur 1. 1. prøvetaking: strekk avslapping innen Vannsøyle av Xylem energibærere Merk: følgende spenning avslapping behandling anbefales før LN2 -programmet for å unngå både frysing og spenning-indusert gjenstander i xylem vann fordelingen. Legg en gren og blader for prøvetaking med en svart plastpose for å likevekt vann potensialet mellom xylem og…

Representative Results

Representative bilder av tverrgående overflater av bartre og løvtrær Tree xylem, observert av fryse-SEM, er vist i figur 2. Ved lav forstørrelse, viser det svarte området i bildene hulrom som vannet helt eller delvis forsvinner, og det grå området indikerer xylem celle vegger, cytoplasma, og vann (figur 2A). Ved høy forstørrelse, er det tydelig at vannet ikke er helt tapt fra Lumina av tre tracheids, ind…

Discussion

The fryse-SEM observasjon metoder innført i dette papiret er praktisk for å tydelig visualisere vann fordelingen på en mobilnettet skala. Gjennom denne metoden, utforske endringene i fordelingen av vann i xylem kan potensielt bidra til å avklare mekanismen av treslag toleranse for abiotiske stress (vannmangel eller frysing) eller biotiske stress (tre sykdom).

Det mest avgjørende skritt i denne metoden er å bevare vann fordelingen karakteristisk for den innfødte vann status under prøvet…

Materials

coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006