Summary

Xylem vand distribution i woody planter visualiseret med en Cryo-scanning elektronmikroskop

Published: June 20, 2019
doi:

Summary

Observation af vandfordelingen i xylem giver betydelige oplysninger om vand flow dynamik i woody planter. I denne undersøgelse demonstrerer vi den praktiske tilgang til at observere xylem vandfordeling in situ ved hjælp af en kryostat og Cryo-SEM, som eliminerer kunstige ændringer i vandets tilstand under prøveforberedelsen.

Abstract

En scanning elektronmikroskopi installeret kryo-enhed (Cryo-SEM) giver mulighed for prøve observation ved temperaturer under frysepunktet og har været anvendt til at udforske vandfordelingen i plantevæv i kombination med freeze fikserings teknikker ved hjælp af flydende nitrogen (LN 2). for woody arter, dog, forberedelser til observation af xylem tværsnit overflade indebærer nogle vanskeligheder på grund af orienteringen af træfibre. Desuden kan højere spændinger i vandsøjlen i xylem ledningskanaler lejlighedsvis forårsage kunstige ændringer i vandfordelingen, især under prøve fiksering og opsamling. I denne undersøgelse demonstrerer vi en effektiv procedure til at observere vandfordelingen inden for xylem af woody planter in situ ved hjælp af en kryostat og Cryo-SEM. I første omgang, under prøven indsamling, måling af xylem vand potentiale bør afgøre, om høj spænding er til stede i xylem ledningskanaler. Når xylems vand potentialet er lavt (< ca. − 0,5 MPa), er der behov for en spændings lempelsesprocedure for at lette en bedre konservering af vandets tilstand i xylem-kanaler under prøve fryse fiksation. Dernæst en vandtæt krave er fastgjort omkring træet stammen og fyldt med LN2 for freeze fiksering af vandets status af xylem. Efter høst skal det sikres, at prøven opbevares frosset, mens procedurerne for prøveforberedelse til observation fuldføres. En kryostat er ansat til tydeligt at eksponere xylem tværsnit overflade. I Cryo-SEM observationer kræves tidsjustering for fryse ætsning for at fjerne frost støv og fremhæve kanten af cellevæggene på betragtnings overfladen. Vores resultater viser anvendeligheden af Cryo-SEM teknikker til observation af vandfordeling inden for xylem på cellulære og subcellulære niveauer. Kombinationen af Cryo-SEM med ikke-destruktiv in situ observation teknikker vil gennemgribende forbedre udforskning af woody plante vand flow dynamik.

Introduction

Tilgængeligheden af vandressourcer (dvs. nedbør, jordens vandindhold) bestemmer nøje dødeligheden og den geografiske fordeling af plantearter, da de er nødt til at absorbere vand fra jorden og transportere den til bladene til fotosyntetisk produktion. Anlæggene skal opretholde deres vand transportsystem under svingende vandforsyninger. Især woody planter generere høje spændinger i deres ledninger langs transpiration vandløb, som i nogle tilfælde, de har brug for at holde deres krone mere end ~ 100 m over jorden. For at opretholde vandsøjler under så højt negativt tryk, xylem ledninger består af et kontinuum af rørformede celler med stive og hydrofobe-lignificerede cellevægge1. Sårbarheden over for xylem dysfunktion af xylem ledninger i hver art er en god afgørende af arten overlevelse under svingende vandforsyning2. Desuden er det vigtigt at studere vandstatus for xylem-kanaler for at vurdere helbredstilstanden for de enkelte træer, der udsættes for abiotiske eller biotiske belastninger. Måling af SAP-flow eller vand potentiale kan give estimater af en woody plantens vandstatus på grund af den integrerede hydrauliske funktion af xylem ledningskanaler. Desuden kan visualisering af vandfordelingen i xylem-celler tydeliggøre tilstanden af de enkelte komponenter i det hydrauliske system xylem.

Flere teknikker til visualisering af vandstatus af xylem ledningskanaler findes3. De klassiske og nyttige metoder til observation af vandveje i trævæv involverer farvning af vandsøjlen ved at nedsænke enderne af afskårne grene i et farvestof eller ved at injicere et farvestof i stående træ stængler4. Soft røntgenfotografering giver også mulighed for visualisering af vandfordeling af skiver træ diske på grund af differential X-ray absorption intensitet af fugt i xylem5,6. Disse metoder, dog kun give spor af vand bevægelse eller demonstrere makroskopiske fordelinger af vand. For nylig ikke-destruktive observations teknikker, såsom Micro Focus X-ray computertomografi (μct)7,8,9,10og magnetisk resonans imaging (MRI)11, 12, er blevet væsentligt forbedret for at tillade observation af vand i xylem ledende inden for intakte træer. Disse ikke-destruktive metoder har store fordele i, at vi kan observere xylem vandstatus uden kunstige skære effekter, og vi kan spore vand flow dynamik ved sekventiel billeddannelse eller indføre en kontrastmiddel10. Men vi er nødt til at bruge en tilpasset MRI for plante billeddannelse eller en specialiseret facilitet for Synchrotron-baserede μCT for at opnå de billeder, der kan identificere cellulære niveau vandindhold. Selv om det synkrotron-baserede μct-system gjorde det muligt at opnå fine billeder med høj rumlig opløsning, som kan sammenlignes med let mikroskopi7,8,9, vil levende celler desuden kunne blive skadet af stråling af høj energi X-ray13,14. Anvendelse af en scanning elektronmikroskop, hvor Cryo-enheder er installeret (Cryo-SEM) er en meget nyttig metode til præcist at lokalisere vandet i xylem på et cellulær niveau, selv om dette kræver en destruktiv høst af prøven til observation. For at fastgøre vandet i xylem ledninger, er en del af stænglerne (dvs., kviste, grene eller stængler) frosset på stedet af flydende nitrogen (LN2). Observationer af overfladen af trimmede, frosne prøver af Cryo-SEM giver meget forstørrede billeder af xylem-strukturen, hvorfra vi kan identificere vandet i xylem-kanaler som is. En væsentlig begrænsning af denne metode er, at sekventiel observation af vand bevægelighed inden for samme prøve er umulig. Men, anvendelsen af μCT eller MRI til sekventiel observation af træer, der lever i et område er yderst udfordrende, fordi disse instrumenter ikke er bærbare. I modsætning hertil har Cryo-SEM et potentiale for at bruge denne teknik på store træer i marken eksperimenter til klart at visualisere vandindhold på ikke kun det cellulære niveau, men også på et finere struktur niveau, f. eks vand i intervaskulære Gruber15, vand i intercellulære rum16, eller bobler i vand kolonne17.

Mange undersøgelser, der iagttog xylem vand af Cryo-SEM er blevet rapporteret 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) indførte oprindeligt protokollen til observation af xylem in situ ved frysning af en levende stamme ved at fylde LN2 i en beholder, der er sat på stænglen21. Prøvens temperatur holdes under-20 °C under prøveudtagningen og under Cryo-SEM-præparation for at undgå smeltning af isen i xylem-kanaler. Denne metode er blevet anvendt til at observere vandet i xylem for at afklare vandfordelingen under skiftende vand regime11,12,24,25,26, 27,28, den sæsonmæssige variation af vandfordeling 21,29,30, virkningen af freeze-tø cyklusser17,31, 32, fordelingen af vand i vådt træ5, ændringer i vandfordelingen under overgangen fra afgrenet til heartwood20, sæsonbestemt tidsforløb af cambial aktivitet og differentiering af fartøjer33, og kavitation induceret af visse biotiske belastninger23,34. Hydraulisk ledningsevne og konduktivitets sårbarhed over for kavitation er også blevet verificeret ved hjælp af Cryo-SEM35,36. Cryo-SEM udstyret med energi udbredt røntgen SPEKTROMETRI (EDX eller EDS) er blevet anvendt til at studere element fordeling over overfladen af en prøve, der indeholder vand37.

Frysning-fiksering af en levende trunk, der indeholder ledninger under høj hydraulisk spænding undertiden forårsager kunstige kavitationer, som er observeret af Cryo-SEM som splittede iskrystaller i lumen af ledningskanaler38,39. Især er løvtræer med længere og bredere kanaler sårbare over for spændinger-induceret artefakter, såsom kavitation forårsaget af prøve skæring, selv om det udføres under vand3,40. Kavitation artefakter bliver iøjnefaldende efter prøvetagning af et indfaldende træ (dvs., prøvetagning i løbet af dagen tid) eller under strenge tørke betingelser, og de kan vildlede til en overvurdering af kavitation forekomst3,38, 39af Derfor skal spændingen, der arbejder i ledningerne, frigives for at undgå den artifaktuel kavitation3,12,39.

Fryse fraktur teknikken ved hjælp af en kniv, der er installeret i et prøvekammer, anvendes ofte til at eksponere prøveoverfladen for Cryo-SEM observation. Dog, fryse-fraktureret planer af woody plante væv, især tværgående sektioner af sekundære xylem, er for ru til klart at observere de anatomiske egenskaber og vand i vævet6. Anvendelsen af en kryostat til trimning af en prøve giver mulighed for hurtig og høj kvalitet fremstilling af prøveflader20,23. Det overordnede mål med denne metode er at tilvejebringe dokumentation med elektronmikroskopi opløsning af vandfordelingen i forskellige former for xylem celler in situ uden forekomst af stikprøveudtagning artefakter. Vi introducerer vores opdaterede procedure, som er blevet støt forbedret siden vi først vedtog det, om prøvetagning, trimning og rengøring af prøveoverfladen for at opnå høj kvalitet elektron mikrografer af Cryo-faste prøver af xylem.

Protocol

Bemærk: et skematisk diagram over denne protokol er vist i figur 1. 1. prøveudtagning: spændings lempelse inden for vandsøjlen af xylem-kanaler Bemærk: følgende spændings lempelses behandling anbefales før LN2 applikationen for at undgå både frysning og spændinger-induceret artefakter i xylem vandfordeling. Der omsluttes en gren og blade til prøveudtagning med en sort plastikpose for at ækvilibrere vand…

Representative Results

Repræsentative billeder af tværsnit overflader af nåletræ og løvtræer med Bredbladet xylem, observeret af Cryo-SEM, er vist i figur 2. Ved lav forstørrelse angiver det sorte område i billederne de hulrum, hvorfra vand helt eller delvis forsvinder, og det grå område indikerer xylem-cellevægge, cytoplasma og vand (figur 2A). Ved høj forstørrelse, er det klart, at vandet ikke er helt tabt fra Lumina af …

Discussion

Cryo-SEM observation metoder indført i dette papir er praktiske til klart at visualisere vandfordeling på en cellulær skala. Gennem denne metode, udforske ændringer i fordelingen af vand i xylem kan potentielt bidrage til at afklare mekanismen af træarter tolerance over for abiotisk stress (vandmangel eller frysning) eller biotisk stress (træsygdom).

Det mest afgørende skridt i denne metode er at bevare vandfordelingen karakteristisk for den indfødte vandstatus under prøven indsamling…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (no. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Materials

coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees – Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision – A test of Scholander’s assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees – Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm?. Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees – Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species?. Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees – Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts?. Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees – Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -. P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

Play Video

Cite This Article
Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

View Video