Xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een Cryo-Scanning elektronenmicroscoop
Summary
Het observeren van de waterdistributie binnen de Xylem geeft belangrijke informatie over de Water stromings dynamiek in bosrijke planten. In deze studie demonstreren we de praktische aanpak om Xylem waterdistributie in situ te observeren met behulp van een cryostat en Cryo-SEM, die artefactuele veranderingen in de water status elimineert tijdens de monstervoorbereiding.
Abstract
Een Scanning elektronenmicroscoop geïnstalleerd Cryo-Unit (Cryo-SEM) maakt specimen observatie op subzero temperaturen en is gebruikt voor het verkennen van waterdistributie in plantaardige weefsels in combinatie met Freeze fixatie technieken met behulp van vloeibare stikstof (LN 2). voor houtachtige soorten, echter, de voorbereidingen voor het observeren van de Xylem transversale-cut oppervlak te betrekken sommige problemen als gevolg van de oriëntatie van houtvezels. Bovendien, hogere spanning in de waterkolom in Xylem leidingen kan soms leiden tot artefactuele veranderingen in de waterdistributie, vooral tijdens de steekproef fixatie en collectie. In deze studie demonstreren we een efficiënte procedure om de waterverdeling binnen de Xylem van bosrijke planten in situ te observeren met behulp van een cryostat en Cryo-SEM. Op het eerste, tijdens de monsterverzameling, het meten van de Xylem water potentiaal moet bepalen of hoge spanning aanwezig is in de Xylem leidingen. Wanneer het Xylem water potentieel laag is (< ca. − 0,5 MPa), is een spannings ontspannings procedure nodig om een betere bewaring van de watertoestand in Xylem leidingen te vergemakkelijken tijdens steekproef bevriezen fixatie. Vervolgens is een waterdichte kraag bevestigd rond de boomstam en gevuld met LN2 voor het bevriezen van de fixatie van de watertoestand van Xylem. Na het oogsten moet ervoor worden gezorgd dat het monster bevroren blijft, terwijl de procedures voor de monstervoorbereiding voor observatie worden voltooid. Een cryostat wordt gebruikt om het Xylem transversale-besnoeiings oppervlak duidelijk bloot te stellen. In Cryo-SEM observaties, is de tijd aanpassing voor vorst-etsen vereist om vorst stof te verwijderen en de rand van de celwanden op de het bekijken oppervlakte te accentueren. Onze resultaten tonen de toepasbaarheid van Cryo-SEM technieken voor de observatie van de waterdistributie binnen Xylem op cellulaire en subcellulaire niveaus. De combinatie van Cryo-SEM met niet-destructieve in situ observatietechnieken zal de exploratie van de hout Stromingsdynamica van de plantaardige water diep verbeteren.
Introduction
Beschikbaarheid van watervoorraden (dat wil zeggen, neerslag, bodem waterinhoud) bepaalt strikt de sterfte en de geografische spreiding van plantensoorten, omdat ze nodig hebben om water te absorberen uit de bodem en het vervoer naar de bladeren voor fotosynthetische productie. De installaties moeten hun systeem van het watervervoer onder fluctuerende watervoorraden handhaven. In het bijzonder, bosrijke planten genereren hoge spanningen in hun leidingen langs de transpiratie stromen als, in sommige gevallen, ze nodig hebben om hun kroon te houden meer dan ~ 100 m boven de grond. Om water kolommen onder zulk hoge negatieve druk te handhaven, bestaan de Xylem leidingen uit een continuüm van tubulaire cellen met stijve en hydrofobe-lignified celwanden1. De kwetsbaarheid voor Xylem dysfunctie van Xylem leidingen in elke soort is een goede determinant van de soorten overleving onder fluctuerende watervoorziening2. Bovendien is het bestuderen van de water status van Xylem leidingen belangrijk voor de evaluatie van de gezondheidstoestand van individuele bomen die aan abiotische of biotische spanningen worden onderworpen. Het meten van SAP flow of water potentiaal kan schattingen geven van de water status van een bosrijke plant door de geïntegreerde hydraulische functie van Xylem leidingen. Bovendien kan het visualiseren van de distributie van water in Xylem cellen de conditie van individuele componenten van het Xylem hydraulisch systeem verduidelijken.
Verscheidene technieken om de water status van Xylem leidingen te visualiseren bestaan3. De klassieke en nuttige methoden voor het observeren van waterwegen in woody weefsel te betrekken kleuring de waterkolom door het onderdompelen van de uiteinden van de gesneden takken in een kleurstof of door het injecteren van een kleurstof in staande boom stengels4. Zachte x-ray fotografie maakt het ook mogelijk de visualisatie van het waterdistributie van gesneden hout schijven als gevolg van de differentiële x-ray absorptie intensiteit van het vocht in Xylem5,6. Deze methodes, echter, verstrekken slechts sporen van water beweging of tonen macroscopische distributies van water aan. Onlangs, niet-destructieve observatietechnieken, zoals MicroFocus X-Ray computertomografie (µ CT)7, 8,9,10en Magnetic Resonance Imaging (MRI)11, 12, zijn significant verbeterd om observatie van water in Xylem leidingen binnen intacte jonge boompjes toe te staan. Deze niet-destructieve methoden hebben grote voordelen in dat we de water status van de Xylem kunnen observeren zonder kunstmatige snij effecten, en we kunnen water Stromingsdynamica volgen door sequentiële beeldvorming of een contrast agent10. Echter, we moeten gebruik maken van een aangepaste MRI voor plant Imaging of een gespecialiseerde faciliteit voor synchotron-based µ CT om de beelden die kunnen identificeren cellulaire niveau waterinhoud te verkrijgen. Bovendien, hoewel het synchotron-based µ CT-systeem in staat om fijne beelden te verkrijgen met een hoge ruimtelijke resolutie, die vergelijkbaar is met de Lichtmicroscopie7,8,9, levende cellen kunnen worden verwond door de straling van hoge energie röntgenstraal13,14. Gebruik maken van een Scanning elektronenmicroscoop waarin Cryo-units zijn geïnstalleerd (Cryo-SEM) is een zeer nuttige methode voor het nauwkeurig lokaliseren van het water in Xylem op een cellulair niveau, hoewel dit vereist destructief oogsten van de steekproef voor observatie. Om het water in Xylem leidingen vast te stellen, wordt een deel van de stengels (d.w.z. twijgen, takken of stengels) in situ bevroren door vloeibare stikstof (LN2). Observaties van het oppervlak van getrimd, bevroren specimens door Cryo-SEM bieden sterk vergrote beelden van de Xylem structuur van waaruit we kunnen het water in Xylem leidingen als ijs te identificeren. Een significante beperking van deze methode is dat de opeenvolgende observatie van water beweeglijkheid binnen de zelfde steekproef onmogelijk is. Nochtans, is de toepassing van µ CT of MRI voor opeenvolgende observatie van bomen die in een gebied leven uiterst uitdagend omdat deze instrumenten niet draagbaar zijn. In tegenstelling, Cryo-SEM heeft een potentieel voor het gebruik van deze techniek op grote bomen in veldexperimenten om duidelijk te visualiseren waterinhoud op niet alleen het cellulaire niveau, maar ook op een fijnere structuur niveau, bijvoorbeeld, water in intervasculaire pits15, water in intercellulaire ruimten16, of bellen in waterkolom17.
Veel studies observeren Xylem water door Cryo-SEM zijn gemeld 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) vestigde aanvankelijk het protocol voor observatie van Xylem in situ door bevriezen-bevestiging van een het leven boomstam via het vullen van LN2 in een container die op de steel wordt geplaatst21. De temperatuur van de steekproef werd gehandhaafd onder-20 °C tijdens steekproef inzameling en tijdens Cryo-SEM voorbereiding om het smelten van het ijs binnen Xylem leidingen te vermijden. Deze methode is gebruikt om het water in Xylem te observeren om de waterverdeling te verduidelijken onder een ander waterregime11,12,24,25,26, 27,28, de seizoensgebonden variatie van waterverdeling21,29,30, het effect van Freeze-ontdooicycli17,31, 32, de verdeling van water in nat hout5, veranderingen in de waterverdeling tijdens de overgang van spint naar heartwood20, seizoengebonden tijdsverloop van cambial activiteit en differentiatie van schepen33, en cavitatie geïnduceerd door bepaalde biotische beklemtoont23,34. Hydraulische geleidbaarheid en leidingen kwetsbaarheid voor cavitatie zijn ook geverifieerd met behulp van Cryo-SEM35,36. Cryo-SEM uitgerust met energie dispersieve röntgenstraal spectrometrie (EDX of EDS) is gebruikt om elementdistributie over de oppervlakte van een specimen te bestuderen dat water37bevat.
Freeze-fixatie van een levende stam die leidingen bevat onder hoge hydraulische spanning veroorzaakt soms kunstmatige cavitatie die worden waargenomen door Cryo-SEM als gebroken ijs kristallen in het lumen van de leidingen38,39. In het bijzonder, loof soorten met langere en bredere leidingen zijn kwetsbaar voor spanning-geïnduceerde artefacten, zoals cavitatie veroorzaakt doorsteek proef snijden, zelfs indien uitgevoerd onder water3,40. De artefacten van de cavitatie worden opvallend na bemonstering van een het transpireren boom (d.w.z., bemonstering tijdens de dag tijd) of onder strenge droogte voorwaarden en zij kunnen aan een overschatting van cavitatie voorkomen misleiden3,38, 39. Daarom moet de spanning die in de leidingen werkt worden vrijgegeven om de artefactuele cavitatie3,12,39te vermijden.
De Freeze-fractuur techniek met behulp van een mes geïnstalleerd in een specimen kamer wordt vaak gebruikt om het monster oppervlak bloot voor Cryo-SEM observatie. Nochtans, zijn de bevriezen-gebroken vliegtuigen van bosrijke installatie weefsels, vooral transversale secties van secundaire Xylem, te ruw om de anatomische eigenschappen en het water in het weefsel6duidelijk waar te nemen. De toepassing van een cryostat voor het trimmen van een specimen maakt een snelle en kwalitatief hoogwaardige voorbereiding van monster oppervlakken20,23mogelijk. Het algemene doel van deze methode is het verstrekken van bewijsmateriaal met elektronenmicroscopie resolutie van de waterverdeling in verschillende soorten Xylem cellen in situ zonder het voorkomen van bemonsterings artefacten. We introduceren onze geactualiseerde procedure, die gestaag is verbeterd sinds we voor het eerst aangenomen, met betrekking tot de bemonstering, trimmen en reinigen van het specimen oppervlak voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige elektronen micrografen van Cryo-vaste monsters van Xylem.
Protocol
Representative Results
Discussion
De Cryo-SEM observatiemethodes die in dit document worden geïntroduceerd zijn praktisch voor duidelijk het visualiseren van waterdistributie op een cellulaire schaal. Door middel van deze methode, het verkennen van de veranderingen in de verdeling van het water binnen Xylem kan potentieel helpen verduidelijken het mechanisme van boomsoorten tolerantie voor abiotische stress (watertekort of bevriezing) of biotische stress (boom ziekte).
De meest cruciale stap in deze methode is het behoud van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI (nr. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
References
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
- Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
- Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees – Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
- Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
- Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
- Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
- Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
- Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
- Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
- Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
- Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
- McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
- Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision – A test of Scholander’s assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
- Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees – Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
- Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
- Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
- Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm?. Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
- Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
- Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
- Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
- Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
- Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
- Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
- Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees – Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
- Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
- Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species?. Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
- Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
- Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees – Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
- Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts?. Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
- Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees – Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
- Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
- Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
- Suuronen, J. -. P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).
