כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.
הטכניקה הכנה מדגם שתואר זה נועד לשלב את האיכות הטובה ביותר של שימור ultrastructural עם הניגוד המתאימים ביותר עבור המודאליות ההדמיה ביון ממוקדת קרן סריקה אלקטרון מיקרוסקופ (שיקרתי-SEM), אשר נמצא בשימוש כדי להשיג ערימות של תמונות רציפים עבור שחזור תלת-ממד, דוגמנות. בלחץ גבוה קפוא (HPF) מאפשר קרוב שימור מבני מקורי, אך עוקבות להקפיא החלפת לעתים קרובות אינו מספק חדות מספקת, במיוחד עבור דגימה גדולה יותר, אשר נדרש עבור הדמיה באיכות גבוהה בעוד SEM הנדרש עבור תלת-ממד שחזור. לכן, ב פרוטוקול זה, לאחר ההחלפה ההקפאה, פעולות מנוגדים נוספות מתבצעות בטמפרטורת החדר. למרות פעולות אלה מבוצעות במיקרוגל, זה גם אפשרי לעקוב אחרי עיבוד ספסל המסורתית, אשר דורשת יותר זמן דגירה פעמים. ההטמעה עוקבות בכמויות מינימליות של שרף מאפשר מהירה ומדויקת יותר מיקוד והכנה בתוך שיקרתי-ב-SEM. פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור דגימות דורשים הכנה על ידי קירור בלחץ גבוה לשימור ultrastructural אמין אך לא יקבלו מספיק חדות במהלך ההחלפה ההקפאה עבור אמצעי הדמיה באמצעות שיקרתי-ב-SEM. בשילוב עם שרף מינימלי את ההטמעה, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה עבור רכישת נתונים באיכות גבוהה נפח.
הקפאה בלחץ גבוה היא שיטת הכנה מדגם של בחירה להשגת שימור ultrastructural באיכות גבוהה, אשר מייצג את המדינה מקורית של מדגם הרבה יותר טוב מאשר שיטות הכנה קונבנציונאלי בעזרת קיבוע כימי1. שיטת הקפאה-הכנה זו שימושית עבור דגימות רקמה העכבר ו2 ו דרישה קפדנית לשימוש של האורגניזם דגם Caenorhabditis elegans3. לאחר החלפת ההקפאה, שרף הטבעה, דגימות אלה מנותחים בדרך כלל על-ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) או אלקטרון טומוגרפיה (ET). אם אמצעי אחסון גדול חייב לדימות באמצעות שיקרתי-SEM או פרצוף-בלוק טורי דימות ברזולוציה גבוהה שחזורים תלת-ממד בקנה מידה גדול, מניסיוננו הדמיה נאותה על ידי SEM היא לעיתים קרובות הקשו על ידי חוסר חדות. שיקרתי-SEM, התמונה נרשם בדרך כלל על-ידי זיהוי אלקטרונים backscattered כשקרן האלקטרונים הראשית. התשואה של אלקטרונים backscattered הוא יחסי לתוכן של מתכות כבדות במדגם. לכן, פרוטוקולים תוכננו במיוחד עבור אמצעי הדמיה כדי לשפר את הניגודיות על-ידי הספגה נוספים הבי מטאל. שיטות כאלה מבוססים על דגימות כימי קבוע להחיל שילוב של אוסמיום ארבע-חמצני-thiocarbohydrazide-אוסמיום ארבע-חמצני4, כפי שתואר על ידי Knott ואח5, רחוב טורי-לפנים, ממוקד יון קרן סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים. שינויים כולל שימוש formamide ו pyrogallol6 או עופרת אספרטט7 הוחלו בהצלחה לטכניקות ההדמיה.
פרוטוקול שסופק כאן משלב הקפאה-הכנת דגימות מאת HPF ומקפיאים החלפה עם עוקבות מיקרוגל בסיוע לעיבוד חדות משופרת באמצעות thiocarbohydrazide/אוסמיום ארבע-חמצני אצטון בטמפרטורת החדר. נדגים זאת על סיבי העצב nervus השוקה של עכברים, Caenorhabditis elegans, אשר מייצגים דוגמאות הדורשים בלחץ גבוה קפוא לשימור ultrastructural באיכות גבוהה. בנוסף, הוא הראה איך, לאחר התייבשות, חדירה, הדגימות מוטבעים עם כמו שרף קטן ככל האפשר. זה שרף מינימלי הטבעה8 מאפשר מיקוד מהיר של המבנה של הריבית, מקצרת את הזמן על עיבוד הדגימה, כולל פחות זמן נדרש לחשוף את האזור עניין בעזרת קרן יון. לאחר ביצוע עוד יותר מדגם צעדים הכנה בתוך המיקרוסקופ, הדמיה, כרסום המדגם מתבצע באופן רציף לרכוש ערימה של תמונות. לוויזואליזציה תלת-ממדית, עיבוד תוכנה (IMOD) תמונה משמש לבנייה מחדש של חלקי ערכת הנתונים.
זרימת העבודה שלנו מתאר איך מנוגדים המתאימים ביותר דוגמאות עבור אמצעי הדמיה של יכול להיות משולב עם שימור ultrastructural בצורה הטובה ביותר על ידי החלפת HPF, ההקפאה. פעולה זו שימושית עבור דגימות שדורשים הקפאה-הכנה בלבד. יישומים מוגבלות מדגמים קטנים זה ניתן להכין על ידי HPF. בדגימות של טבע שונים, כגון חומר צמחי או מיקרואורגניזמים, פרוטוקול זה דורש הסתגלות.
הפרוטוקול פותחה כדי להמחיש את שימור אופטימלית והניגודיות כדי לבצע הדמיה בלוק טורי-פרצוף עם שיקרתי ב- sem לכן, בחרנו ליישם הקפאה-הנייח ואחריו פוסט-צביעת באמצעות הקפאת החלפת ועיבוד בסיוע מיקרוגל. לכן, פרוטוקול זה הוא מוגבל כי הם קטנים מספיק עבור לקפוא בלחץ גבוה. מגבלות גודל של 3 עד 6 מ מ רוחב ועובי של מיקרומטר ~ 200 נקבעו לפי גודל מדגם ההובלה, אשר תואם את גודל המדגם זה שיכול להיות קפוא כראוי בטכניקה זו. זה רלוונטי עבור המדגם עצב העכבר, מכיוון בעצב גדול מדי בקוטר להשתלב נושאות 0.2 מ מ הנדרשים כדי להבטיח הקפאה נכונה. לכן, מומלץ ניתוח זהיר של עצב קטנים יותר כגון העצב הטיביאלי או עצב דק אחרים כגון העצב הירך. מאז למעטפת מיאלין רגישה מותח, נהדר חייבים להקפיד במהלך ניתוח של עצב רענן בר -קיימא כדי למנוע טיפול חפצים. באופן כללי, מעשית דוגמאות בלבד אמור לשמש ללימודי מיקרוסקופית אלקטרונים.
עיבוד בסיוע מיקרוגל והטבעה שרף מינימלי מתוכננים להאצת ההכנה ומיקוד בתהליך. עיבוד בסיוע מיקרוגל החלת השינוי OTO פרוטוקול4 משמש עבור קיבוע כימי בטמפרטורת החדר. מיקרוגל ביתי לא תניב את אותן תוצאות, שכן יש אין חלוקה הומוגנית של גלי מיקרו, הטמפרטורה שלו לא נשלט, יש אין ואקום זה יכול להיות מיושם. קטן יותר לדוגמה, חדירה טובה יותר של הכימיקלים; לכן, התוצאות הטובות ביותר מושגות על ידי דגימות קטנות יותר. כדי למנוע נזק המדגם על ידי התחממות יתר, בקרת טמפרטורה ויישום של הכוח המינימלי הדרוש מיקרוגל הם קריטיים. ניתן לבצע את השלבים בעיבוד בסיוע מיקרוגל על הספסל אם אין מיקרוגל זמינים, אשר יוביל פעמים עיבוד ארוך יותר. ישירות מטרה מבנים בעוד SEM, זה הכרחי להסיר כמה שיותר שרף ככל האפשר מהחלק העליון של המדגם. לאחר הקלטת dataset, שלאחר עיבוד של הנתונים הגולמיים יש צורך להקטין את גודל הקובץ וגם לשפר את יחס אות לרעש. טכניקות הדמיה כרך מודרני לייצר כמויות גדולות של נתונים. לכן, כדי לבצע עיבוד נתונים בצורה מספקת ומהירה, דרוש זיכרון RAM המספיק בתחנת העבודה. לפעולות יישור נדרש לפחות שתי פעמים יותר RAM כגודל הנתונים (dataset).
פרוטוקול זה נבדקו על השוקה nervus של העכבר באותה מידה כמו C. elegans. אולם ואח. 12 שימוש צעד שיפור דומה לאחר החלפת ההקפאה שלהם על הספסל להכנה של C. elegans. עבור כל שאר אורגניזם מודל כמו דג זברה, התאמות של הפרוטוקול הם הצורך סביר. שינוי אפשרי אחד הוא לשנות את ההרכב של ההחלפה ההקפאה קוקטייל, כמו למשל על ידי הוספת מים המשמש עבור שיפור ניגודיות18. יתר על כן, משך ההחלפה ההקפאה יש להתאים את הדגימה, יכול להתקצר במידה ניכרת על-פי פרוטוקול החלפת19הקפאה מהירה. אפשרות אחת היא היישום של עצבנות עבור מאיץ את תהליך החלפת ההקפאה20. לאחר ההחלפה ההקפאה, עוד שינויים אפשריים, כגון יישום חוזר ונשנה של שיפור כימיקלים, אוסמיום ארבע-חמצני21. במהלך עיבוד מיקרוגל, טמפרטורה, דגירה פעמים, הגדרות צריכת החשמל יכולים להיות מגוונים כדי למטב את תוצאות המדגם בהתאמה.
פרוטוקול זה מראה כי שיפור כזה יכול להיות משולב עם הקפאת החלפת פרוטוקולים אחרים וסוגים שונים של דגימות כפי שתואר על ידי מסדרון12 הם צילמו שיקרתי-SEM או באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה בלוק טורי-פרצוף. טכניקות הדמיה אלה דורשים חדות משופרת, וזה פחות חשוב במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
The authors have nothing to disclose.
שיקרתי-SEM של א. צ. (המיקום של המפעיל שיקרתי-SEM) ממומנות על ידי האשכול של מצוינות, דויטשה פתוח (DFG) מחקר מרכז הננומטרי מיקרוסקופ ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB). אנו מודים המעבדה של תומאס מולר-רייכהרט למתן את הדגימות C. elegans . אנו מודים אולריך וייקרט על השתתפות בסרט.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |