JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
환경과학

Microfocus X-Ray CT (microCT) imagem latente de Actinia equina da (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), e Xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Published: August 06, 2019
doi:
10.3791/59161
, , ,
1Mammalian Genetics Laboratory,National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station,The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center,University of Tsukuba

Summary

Aqui, os protocolos para executar a imagem latente do tomography computado do raio X do microfoco (microct) de três animais marinhos do invertebrados são explicados em detalhe. Este estudo descreve etapas tais como a fixação da amostra, a mancha, a montagem, a exploração, a reconstrução da imagem, e as análises de dados. Sugestões sobre como o protocolo pode ser ajustado para diferentes amostras também são fornecidos.

Abstract

Tradicionalmente, os biólogos tiveram que depender de métodos destrutivos, como o corte, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. A imagem latente não-destrutiva do tomography computado do raio X do microfoco (microCT) transformou-se um protocolo poderoso e emergente na biologia, devido aos avanços tecnológicos em métodos e nas inovações de coloração da amostra no hardware de microCT, em computadores de processamento, e em dados software de análise. No entanto, este protocolo não é comumente usado, como é nos campos médico e industrial. Uma das razões para esse uso limitado é a falta de um manual simples e compreensível que cubra todas as etapas necessárias: coleta de amostras, fixação, coloração, montagem, digitalização e análise de dados. Outra razão é a grande diversidade de metazoanos, particularmente invertebrados marinhos. Por causa dos diversos tamanhos, morfologias e fisiologias dos invertebrados marinhos, é crucial ajustar as condições experimentais e as configurações de hardware em cada etapa, dependendo da amostra. Aqui, os métodos da imagem latente de microct são explicados em detalhe usando três invertebrates marinhos filogeneticamente diversos: equina da de actinia (Anthozoa, Cnidaria), SP. de harmothoe (Polychaeta, Annelida), e japonica de Xenoturbella ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Sugestões sobre a realização de imagens microCT em vários animais também são fornecidos.

Introduction

Pesquisadores biológicos geralmente tiveram que fazer cortes finos e realizar observações por microscopia de luz ou eletrônica, a fim de investigar as estruturas internas de organismos opacos. No entanto, esses métodos são destrutivos e problemáticos quando aplicados a espécimes raros ou valiosos. Além disso, várias etapas no método, como incorporação e corte, são demoradas e pode demorar vários dias para observar uma amostra, dependendo do protocolo. Além disso, ao manusear inúmeras secções, existe sempre a possibilidade de danificar ou perder algumas secções. As técnicas do tecido-esclarecimento estão disponíveis para alguns espécimes1,2,3,4,5 mas não são ainda aplicáveis para muitas espécies animais.

Para superar esses problemas, alguns biólogos começaram a usar a tomografia computadorizada de raios X microfoco (microct) Imaging6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Na TC de raios-X, o espécime é irradiado com raios-X de vários ângulos que são gerados a partir de uma fonte de raios-X movendo-se em torno da amostra, e os raios-X transmitidos são monitorados por um detector que também se move em torno da amostra. Os dados de transmissão de raios-X obtidos são analisados para reconstruir imagens transversais do espécime. Este método possibilita a observação de estruturas internas sem destruição da amostra. Por causa de sua segurança e facilidade, é comumente usado em aplicações médicas e odontológicas, e os sistemas de TC podem ser encontrados em hospitais e centros odontológicos em todo o mundo. Além disso, o raio X Industrial CT é usado freqüentemente observando amostras não médicas para a inspeção e a metrologia no campo industrial. Em contraste com a TC médica, na qual a fonte de raios X e os detectores são móveis, as duas partes são fixadas em TC Industrial, com a amostra girando durante a digitalização. A TC Industrial geralmente produz imagens de maior resolução do que a TC médica e é referida como microCT (resolução em nível de micrômetro) ou nanoCT (resolução em nível de nanômetro). Recentemente, a pesquisa usando microct aumentou rapidamente em vários campos da biologia14,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34.

Os estudos biológicos que usam o CT inicialmente alvejou estruturas internas que consistem principalmente no tecido duro, tal como o osso. Avanços nas técnicas de coloração utilizando vários agentes químicos permitiram a visualização de tecidos moles em vários organismos6,7,8,9,14,15 , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34. destes reagentes, os agentes de contraste à base de iodo são relativamente seguros, baratos e podem ser utilizados para a visualização de tecidos moles em vários organismos7,14. No que diz respeito aos invertebrados marinhos, a microtomografia tem sido amplamente utilizada em animais como moluscos6,25,32,33, anípidos18,19, 20 anos de , 28, e arthorópodes21,23,29,31. No entanto, houve poucos relatos sobre outros animais phyla, como briozoários6, xenacoelomorphs26e cnidários24,30. Em geral, houve menos estudos usando microCT em invertebrados marinhos do que aqueles em vertebrados. Uma das principais razões para este uso limitado em invertebrados marinhos é a vasta diversidade observada nestes animais. Por causa de seus diversos tamanhos, morfologias e fisiologias, cada espécie reage diferentemente a diferentes procedimentos experimentais. Portanto, é crucial durante a preparação da amostra escolher o reagente de fixação e coloração mais adequado, e definir as condições em cada etapa, ajustadas para cada espécie. Da mesma forma, também é necessário definir as configurações de digitalização, como o método de montagem, tensão, corrente, taxa de ampliação mecânica e o poder de resolução de espaço, apropriadamente para cada amostra. Para superar esse problema, um manual simples e compreensível que abrange todas as etapas necessárias, explica como cada etapa pode ser ajustada dependendo da amostra, e mostra exemplos detalhados de várias amostras é essencial.

No presente estudo, descrevemos o protocolo de imagem microCT passo a passo, desde a fixação da amostra até a análise dos dados, utilizando-se três espécies de invertebrados marinhos. Os espécimes da Anemone de mar Actinia equina da (Anthozoa, Cnidaria) foram recolhidos perto da Estação Biológica Marinha de Misaki, Universidade de Tokyo. Eles tinham um corpo esférico e macio que tinha cerca de 2 cm de diâmetro (Figura 1a-C). As amostras de Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) também foram coletadas perto da Estação Biológica Marinha Misaki. Eram vermes finos que tinham cerca de 1,5 cm de comprimento, com cerdas resistentes presentes ao longo de todo o corpo (Figura 1D). Um espécime Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) foi coletado perto do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, durante a 13ª pesquisa conjunta do organismo costeiro jambio. Era um verme macio-encorpado que tinha cerca de 0,8 cm de comprimento (Figura 1e). Os ajustes feitos para as condições e as configurações de cada amostra são explicados em detalhe. Nosso estudo fornece várias sugestões sobre como executar a imagem microCT em invertebrados marinhos, e esperamos que ele inspire os biólogos a utilizar este protocolo para sua pesquisa.

Protocol

1. fixação Para Actinia equina da, relaxe os animais em 10% MgCl2 água do mar por cerca de 15 min à temperatura ambiente. Transfira para 70% etanol e armazene à temperatura ambiente. Para Harmothoe SP., anestesiar os animais, colocando-os em água do mar gelada por cerca de 15 min. transferência para 10% (v/v) solução de formalina com água do mar e armazenar à temperatura ambiente. Para Xenoturbella japonica, relaxe o animal usando 7% MgCl…

Representative Results

Nós executamos a imagem latente de microCT em a . equina da (Anthozoa, Cnidaria), SP. de Harmothoe (Polychaeta, Annelida), e X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) após ter manchar as amostras com a solução de Lugol de 25%. A coloração melhorou com sucesso o contraste das estruturas internas em todos os espécimes, possibilitando observações de tecidos moles internos (Figura 6). Juntamente com os relatórios passados6,</s…

Discussion

Os fixadores que utilizam formalina, como a solução de formalina a 10% (v/v) em água salgada utilizada neste estudo, são conhecidos por preservar a morfologia de diversos invertebrados marinhos e são freqüentemente utilizados para a microtomografia computadorizada18,24,25 ,26,28,30,33…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Toshihiko Shiroishi por sua assistência e por fornecer o ambiente de pesquisa durante este estudo. Estamos gratos a Kensuke Yanagi e Takato Izumi por conselhos sobre a . equina da, e Masaatsu Tanaka para aconselhamento sobre o espécime Harmothoe SP. Gostaríamos de agradecer aos funcionários do Shimoda Marine Research Center, da Universidade de Tsukuba, e Misaki Marine Biological Station, a Universidade de Tóquio para a sua ajuda em coleções de amostras. Gostaríamos de agradecer a Editage (www.editage.jp) para edição de idioma inglês. Este trabalho foi apoiado pelo JSPS Grant-in-Aid para jovens cientistas (A) (JP26711022) para HN, e JAMBIO, Associação Japonesa de biologia marinha.

Materials

250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).

Tags

MicroCTActinia EquinaHarmothoe Sp.Xenoturbella JaponicaMarine InvertebratesSample MountingAgaroseStainingSample Preparation
check_url/kr/59161?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image