MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)
Summary
Hier worden protocollen voor het uitvoeren van micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging van drie mariene ongewervelde dieren gedetailleerd uitgelegd. Deze studie beschrijft stappen zoals monster fixatie, kleuring, montage, Scanning, beeld reconstructie en data-analyses. Suggesties over hoe het protocol kan worden aangepast voor verschillende monsters worden ook verstrekt.
Abstract
Traditioneel hebben biologen moeten vertrouwen op destructieve methodes zoals snijden om de interne structuren van ondoorzichtige organismen te onderzoeken. Niet-destructieve micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging is uitgegroeid tot een krachtig en opkomende protocol in de biologie, als gevolg van technologische vooruitgang in monster kleurings methoden en innovaties in microCT hardware, processing computers, en data analyse software. Dit protocol wordt echter niet vaak gebruikt, zoals het is in de medische en industriële gebieden. Een van de redenen voor dit beperkte gebruik is het ontbreken van een eenvoudige en begrijpelijke handleiding die alle noodzakelijke stappen omvat: monsterverzameling, fixatie, kleuring, montage, Scanning en gegevensanalyses. Een andere reden is de enorme diversiteit van metazoanen, met name mariene ongewervelde dieren. Door de uiteenlopende afmetingen, morfologieën en fysiologieën van mariene ongewervelde dieren is het van cruciaal belang om de experimentele omstandigheden en hardwareconfiguraties bij elke stap aan te passen, afhankelijk van het monster. Hier worden microCT-beeldvormingsmethoden gedetailleerd toegelicht met behulp van drie phylogenetisch diverse mariene ongewervelde dieren: Actinia equina (anthozoa, Cnidaria), Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) en xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Er worden ook suggesties gegeven voor het uitvoeren van microCT-beeldvorming op verschillende dieren.
Introduction
Biologische onderzoekers hebben over het algemeen dunne secties moeten maken en waarnemingen moeten verrichten door licht of elektronenmicroscopie om de inwendige structuren van ondoorzichtige organismen te onderzoeken. Deze methoden zijn echter destructief en problematisch wanneer ze worden toegepast op zeldzame of waardevolle specimens. Bovendien zijn verschillende stappen in de methode, zoals insluiten en snijden, tijdrovend en kan het enkele dagen duren voordat een voorbeeld wordt nageleefd, afhankelijk van het protocol. Bovendien, bij het hanteren van tal van secties, is er altijd een mogelijkheid van beschadiging of verlies van sommige secties. Weefsel clearing technieken zijn beschikbaar voor sommige specimens1,2,3,4,5 maar zijn nog niet van toepassing op veel diersoorten.
Om deze problemen te overwinnen, zijn sommige biologen begonnen met het gebruik van micro focus röntgenfoto computertomografie (microct) beeldvorming6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. In X-Ray CT wordt het preparaat bestraald met röntgenstralen vanuit verschillende hoeken die worden gegenereerd uit een röntgenbron die rond het monster beweegt, en worden de verzonden röntgenstralen bewaakt door een detector die ook rond het monster beweegt. De verkregen X-Ray transmissiegegevens worden geanalyseerd om transversale beelden van het preparaat te reconstrueren. Deze methode maakt de observatie van interne structuren mogelijk zonder vernietiging van het monster. Vanwege de veiligheid en het gemak, het wordt vaak gebruikt in medische en tandheelkundige toepassingen, en CT-systemen kunnen worden gevonden in ziekenhuizen en tandheelkundige centra wereldwijd. Bovendien wordt industriële X-Ray CT vaak gebruikt voor het observeren van niet-medische monsters voor inspectie en metrologie in het industriële gebied. In tegenstelling tot de medische CT, waarin de röntgenbron en de detectoren mobiel zijn, zijn de twee onderdelen bevestigd in industriële CT, waarbij het monster wordt gedraaid tijdens het scannen. Industriële CT produceert over het algemeen hogere resolutie beelden dan medische CT en wordt aangeduid als microCT (micrometer-niveau resolutie) of nanoCT (nanometer-niveau resolutie). Onlangs is onderzoek met behulp van microct snel toegenomen in verschillende gebieden van de biologie14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
Biologische studies met behulp van CT aanvankelijk gerichte interne structuren die voornamelijk bestaan uit harde weefsel, zoals bot. Vooruitgang in kleurings technieken met behulp van verschillende chemische agentia stelde de visualisatie van zachte weefsels in verschillende organismen6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. van deze reagentia zijn op jodium gebaseerde contrastmiddelen relatief veilig, goedkoop en kunnen worden gebruikt voor de visualisatie van zachte weefsels in verschillende organismen7,14. Wat mariene ongewervelde dieren betreft, is microct op grote schaal gebruikt voor dergelijke diersoorten, zoals weekdieren6,25,32,33, tot18,19, 20 , 28, en arthoropods21,23,29,31. Er zijn echter weinig rapporten over andere dier fyla, zoals bryozoërs6, xenacoelomorphs26en cnidariërs24,30. Over het algemeen zijn er minder studies met behulp van microCT op mariene ongewervelde dieren dan die op gewervelde dieren. Een belangrijke reden voor dit beperkte gebruik op mariene ongewervelde dieren is de enorme diversiteit die in deze diersoorten wordt waargenomen. Door hun uiteenlopende afmetingen, morfologieën en fysiologieën reageert elke soort verschillend op verschillende experimentele procedures. Daarom is het van cruciaal belang tijdens de monstervoorbereiding om de meest geschikte fixatie-en kleurings reagens te kiezen en voorwaarden vast te stellen bij elke stap, aangepast voor elke soort. Evenzo is het ook noodzakelijk om de scan configuraties in te stellen, zoals de montagemethode, spanning, stroom, mechanische vergrotings snelheid en het ruimte resolutievermogen, op passende wijze voor elk monster. Om dit probleem te overwinnen, een eenvoudige en begrijpelijke handleiding die alle van de nodige stappen dekt, legt uit hoe elke stap kan worden aangepast afhankelijk van het specimen, en toont gedetailleerde voorbeelden uit meerdere monsters is essentieel.
In de huidige studie beschrijven we het microCT Imaging protocol stap voor stap, van monster fixatie tot gegevensanalyse, met behulp van drie ongewervelde mariene soorten. Specimens van de zeeanemonen Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) werden verzameld in de buurt van het Misaki Marine Biological station, de Universiteit van Tokio. Ze hadden een sferische, zachte Body die ongeveer 2 cm in diameter was (Figuur 1a-C). Harmothoe SP. (Polychaeta, Annelida) monsters werden ook verzameld in de buurt van Misaki Marine Biological station. Het waren slanke wormen die ongeveer 1,5 cm lang waren, met stoere chaetae aanwezig langs het hele lichaam (figuur 1d). Een Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) specimen werd verzameld in de buurt van Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, tijdens het 13e JAMBIO Coastal organisme joint Survey. Het was een zacht-bodied worm die ongeveer 0,8 cm lang was (Figuur 1e). Aanpassingen voor de voorwaarden en configuraties van elk monster worden gedetailleerd toegelicht. Onze studie biedt verschillende suggesties voor het uitvoeren van microCT-beeldvorming op mariene ongewervelde dieren, en we hopen dat het biologen zal inspireren om dit protocol voor hun onderzoek te gebruiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fixatieven die formaline gebruiken, zoals de 10% (v/v) formaline oplossing in zeewater die in deze studie wordt gebruikt, zijn gekend om de morfologie van diverse mariene ongewervelde dieren te behouden en worden vaak gebruikt voor microct-beeldvorming18,24,25 ,26,28,30,33. Beperkingen op h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Toshihiko Shiroishi graag bedanken voor zijn hulp en voor het verstrekken van de onderzoeksomgeving tijdens deze studie. We zijn Kensuke Yanagi en Takato Izumi dankbaar voor advies over A. equinaen Masaatsu Tanaka voor advies over het Harmothoe SP. specimen. We willen de medewerkers van het Shimoda Marine Research Center, de Universiteit van Tsukuba en het Misaki Marine Biological station, de Universiteit van Tokio, bedanken voor hun hulp in sample collecties. We willen graag Editage (www.editage.jp) bedanken voor de Engelse taal bewerking. Dit werk werd gesteund door de JSPS-subsidie-in-Aid voor jonge wetenschappers (A) (JP26711022) aan HN en JAMBIO, Japanse Vereniging voor mariene biologie.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
