Summary
Этот протокол описывает методологии для количественного определения двигательного поведения и сна в мексиканской cavefish. Предыдущий анализ распространяются для измерения этих поведений в социально размещается рыбы. Эта система может быть широко применяется для изучения сна и деятельности в других видов рыб.
Abstract
Различных типов сон характеризуется весьма сохранены поведенческие характеристики, которые включают в себя повышенное возбуждение порог, отскок после лишения сна и сводный периодов поведенческих неподвижности. Мексиканский cavefish Астианакт гракл (A. гракл), представляет собой модель для изучения эволюции черта в ответ на экологические возмущений. A. гракл существуют как голубоглазых поверхности жилые формы и несколько слепой местонахождения троглофильных населения, которые имеют надежные морфологических и поведенческих различий. В нескольких, независимо эволюционировали cavefish населения произошла потеря сна. Этот протокол описывает методологию количественной оценки сна и двигательной активности в A. гракл пещеры и поверхности рыбы. Экономически эффективные системы видеонаблюдения позволяет поведенческих изображений индивидуально размещается личинок и взрослых рыб для периодов в неделю или больше. Система может применяться для рыб оплодотворение пост возрасте 4 дней до зрелого возраста. Этот подход также может быть адаптирована для измерения воздействия социальных взаимодействий на сон, записав несколько рыб в одном Арена. После поведенческие записи данные анализируются с помощью автоматизированного отслеживания программного обеспечения и анализ сна обрабатывается с помощью пользовательских сценариев, которые количественно определить несколько переменных сна, включая продолжительность, продолжительность схватки и схватки номер. Эта система может применяться мера сна, суточного поведение и двигательной активности в практически любых видов рыб, включая данио рерио и sticklebacks.
Introduction
Сон очень сохраняется во всем животном в физиологических, функциональные и поведенческие уровни1,2,3. Во время сна у лабораторных млекопитающих животных обычно оценивается с помощью электроэнцефалограмм, электрофизиологические записи менее практичными в маленькую генетически поддаются модель систем и таким образом сна обычно измеряется на основании поведения3 , 4. поведенческие характеристики, связанные с сна очень сохраняются во всем животном и включают в себя повышенное возбуждение порог, обратимость стимуляции, и длительное поведенческих покоя5. Эти меры может использоваться для характеристики сна в животных, начиная от нематод червя нематоды Caenorhabditis elegans, через людей6.
Использование поведенческих покоя характеризовать сна требует автоматизированного отслеживания программного обеспечения. С отслеживания программного обеспечения, периоды активности и неподвижность определяются через несколько дней, и длительные периоды бездействия, классифицируются как спать7,8. В последние годы были разработаны несколько систем отслеживания для получения данных о деятельности среди многообразия систем малых генетически поддаются модель; включая червей, плодовых мух и рыбы9,10,11. Эти программы сопровождаются программного обеспечения, которое позволяет для автоматизированного отслеживания поведения животных, включая как freeware открытым исходным кодом, так и коммерчески доступное программное обеспечение7,12,13,14 . Эти системы отличаются в их гибкости и разрешить для эффективного отбора и определения характеристик фенотипов сна в многочисленных генетически исправимый модели.
Генетическое исследование сна в данио рерио данио рерио, привела к выявлению множества генов и нейронных цепей, которые регулируют сон15,16. Хотя это обеспечил мощную систему для расследования нейронной основе сна в позвоночных лабораторных животных, гораздо меньше известно о как развивается сна и как естественные вариации способствует спать регулирования. Мексиканский cavefish, Астианакт гракл (A. гракл), произошли резкие различия в сон, двигательной активности и циркадные ритмы17,18. Эти рыбы существуют как голубоглазых поверхности рыб, которые обитают рек Мексики и Южной Техас и по крайней мере 29 пещера населения во всем регионе Сьерра-дель-Abra северо-востоке Мексики19,,2021. Удивительно многие поведенческие различия, включая потерю сна, как представляется, возникли независимо в нескольких cavefish населения14,22. Таким образом cavefish обеспечивают модель для изучения конвергентной эволюции сна, спать, и социального поведения.
Этот протокол описывает систему для измерения сна и двигательного поведения в A. гракл личинок и взрослых. Заказ на основе инфракрасного записи система позволяет для записи видео животных в светлых и темных условиях. Коммерчески доступное программное обеспечение может использоваться для измерения активности и пользовательские макросы используются для количественного определения некоторых аспектов бездействия и определить периоды сна. Этот протокол также описывает экспериментальных изменений для отслеживания активности несколько животных в танк, предоставляя возможность изучения взаимодействия между сна и социального поведения. Эти системы могут применяться для измерения сна, суточного поведение и двигательной активности в дополнительных рыб, включая данио рерио и sticklebacks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Настройка системы для отслеживания поведения в личинок и взрослых.
1. Построение системы сна для личинок
Примечание: Системы мониторинга для отслеживания личинок через молоди в возрасте 4 дней поста оплодотворение (dpf) через 30 dpf A. гракл требует несколько единиц оборудования, включая инфракрасные (ИК) освещение, акрил IR света диффузоры, автоматизированные свет элементы управления (таймеры), компьютеры, камеры и вторичных материалов, таких как проводки и контроллеры питания (рис. 1A). Следующие инструкции будут информировать как построить систему для точного отслеживания двигательного поведения для изучения сна и циркадные ритмы в личиночной A. гракл.
- Построить систему освещения, состоящий из ИК и белый светоизлучающие диоды (LED): место три IR свет в треугольник приблизительно 7,62 см друг от друга на теплоотвод тонкая металлическая платформа 30,5 x 30,5 см. Провод огни в серии с электрических проводов и подключение к источнику питания.
- Поместите один белый свет Светодиодные в центре трех огней ИК и прикрепить их к источнику питания.
- Подключите источник питания для светодиод света таймера равным стандартной суточного времени.
- Постройте платформу для системы отслеживания личинок. Использование 0,33 см акрил толщиной белый знак для всех компонентов платформы.
- Место записи платформы на вершине освещенной площади теплоотвод, на котором аренах содержащие рыбы будет находиться во время поведения отслеживания.
-
Место второй акрил внутри поле между огнями и животных для диффузного ИК для оптимального освещения и контраст.
Примечание: размеры для личинок Лайтбокс является следующим: два 18 x 8.5 см и два 17 x 8.5 см светодиодов, которые химически связаны вместе в форме 18 x 18 см квадрат это 8,5 см высотой. Кроме того акрил могут быть легко вырезать или просверленные с помощью правильных инструментов для индивидуальных размеров.- Место весь личиночной отслеживания стадии и установка освещения в рамках закрытых пластиковую трубку и затем разместите камеру на верхней части трубки.
Примечание: Важно сохранить освещения отражений от появления на отслеживание видео, поскольку это нарушит точность отслеживания. Размещение камеры на верхней части трубки, которая окружает платформы улучшает освещения и резкости для камер, которые используются для этих экспериментов.
- Место весь личиночной отслеживания стадии и установка освещения в рамках закрытых пластиковую трубку и затем разместите камеру на верхней части трубки.
- Управлять веб-камерой (см. Таблицу материалы) для записи на основе ИК. Удаление объектива производитель, используя роторный инструмент (см. Таблицу материалы).
- Снимите небольшой серебряный винта на обратной стороне камеры для удаления внутренний корпус.
- Снимите небольшой черный винты внутри корпуса камеры, чтобы ослабить оставшуюся часть объектива. Используйте маленькую отвертку для удаления любой части корпус объектива, что осталось после резки объектив.
- Удалить синий светодиод на верхней части заряженных сочетании устройства (CCD) жилья.
- Поставил камеру обратно вместе, поместив внутренний корпус вернуться к исходной ориентации и завинчивания серебряные два винта обратно в их первоначальное положение.
- Маршрут внутри камеры, с помощью небольшой увидел в соответствии с немного округлые пластмассовые маршрутизации. Заглаживают дополнительных пластиковых до тех пор, пока она может поместиться адаптер объектива.
- Установка ИК-фильтр внутри камеры как можно ближе к КБО как можно без внесения прямого контакта с помощью камеры.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить CCD чип в корпус камеры. Не забудьте сохранить сокращение уровня, как это возможно. Печать любого открытого пространства между внешней ИК-фильтром и тело камеры держать свет от достижения КБО не фильтруются. - Прикрепите камеры с объективом 35 мм фиксированной (см. Таблицу материалы) путем завинчивания адаптер передней камеры в задней части объектива.
- Поместите камеру и объектив в отверстие, просверленное в крышку верхней части трубки, что дома сцену и огни и подключите USB к компьютеру, записанный животных от.
Примечание: Место рыбы в комнате поведение, что отдельно от где размещаются запасов рыбы для обеспечения минимальной сбоев во время поведенческих записи. Позаботьтесь, чтобы свести к минимуму колебания температуры и вентиляции, которая может сбить с толку поведенческих экспериментов.
2. Сон системы для взрослых
- Постройте систему освещения ИК для отслеживания взрослых рыб путем разрезания ИК полосы приблизительно 46 см интервалы. Один из 46 см газа достаточно для каждого танка поведение 10 Л.
- Провод каждого газа вместе в серии, пайка каждого газа для DC электрического провода и прикрепить к источнику питания 9 V.
- Придают каждой полосы ИК 51 x 5,1 см кусок алюминия, который будет выступать в качестве поглотителя тепла.
- Место 46 см х 5 см, 0,32 см 9% белый знак света перевал акриловый лист толщиной непосредственно перед каждой ИК полосы для диффузного IR свет.
- Поместите все танки на стойку, который поддерживает монтируемые сзади ИК освещение.
- Непрозрачные пластиковые разделители в 10 Л стекло цистерн можно используйте для создания отдельных аренах.
Примечание: Размер арены может быть изменено на основе количество используемых разделителей и размер бака. Арена размер влияет на двигательную активность и сна в пещере и поверхности рыбы23. - Монтировать камеры примерно 4-6 м от танков. Каждая камера может обычно записывать от 3 танки одновременно обеспечить достаточное разрешение для отслеживания.
Примечание: Взрослых поведенческого записи обычно системы не требуется отдельный белого освещения для управления изменениями день ночь. Просто используя стандартный верхний свет в комнате поведенческих, подключен к таймеру, вероятно, будет достаточно.
3. запись двигательной активности
Примечание: Все поведенческие записи производятся с использованием стандартной ноутбук или настольных с источником резервной батареи. Из-за большой размер файлов 24 часа записи (60-100 ГБ) Сохраните все записи на внешние жесткие диски.
- Акклиматизироваться рыб возраст 4-30 dpf для 18-24 часа до начала записи. Кормить личинок рыб с живой артемии впервые помещенный в зале звукозаписи и 1 час до начала записи. Акклиматизироваться взрослых рыб 4-5 дней до записи поведение и кормить один раз в день с хлопьеобразный корм или с живой blackworms.
Примечание: Не забудьте поставить личинок рыб в пресной воде до записи, как остатки артемии вызовет проблемы отслеживания в ходе последующего анализа. Совместного культивирования с коловраток предоставляет альтернативный вариант, как их малые размеры не вмешиваться с отслеживанием. - Место рыбы в возрасте 4-6 dpf в 24-ну тканевые культуры пластин. Дом рыбы в возрасте 20-30 dpf в культуре ткани 12-ну пластины для записи.
- Запись взрослых в 10 Л емкости подходят с разделители, чтобы вместить пять индивидуально размещены рыбы, или без разделители записи сна и деятельности в социальной обстановке.
Примечание: Позаботьтесь, чтобы сфокусировать камеру до начала записи, чтобы максимизировать точность отслеживания. Не открывайте диафрагмой объектива камеры слишком далеко, поскольку это позволит резко снизить резкость изображения. Существует баланс, однако; Если Ирис закрыта слишком далеко, частота кадров видео будет падать ниже 15.00 fps. Это важно для последующего анализа, что частота кадров остается 15.00 кадров в s для использования с некоторыми сценарий пользовательской сна23,24. - Установите яркость освещения фона истолкования.
- Оптимизируйте освещение до начала записи. Всегда держите контраст на самом высоком уровне возможно и использовать яркости и Фоновой подсветки для регулировки яркости до животных, наиболее ясно.
- Запись рыбы за 24 или 48 ч.
Примечание: Чрезвычайных резервной батареи пакеты, которые все освещение, компьютеры и камеры должны быть приобретены в случае отключения питания. Все батареи должен быть подключен в чрезвычайных розеток, если это возможно. Батареи будет вообще не мощность оборудования для более чем несколько минут до часа в большинстве и служат мостом между потери питания и передача в систему аварийного питания.
4. анализ двигательной активности в индивидуальном здании рыбы с помощью автоматизированных отслеживания программного обеспечения
- Чтобы начать анализ поведения, откройте программное обеспечение отслеживания, выберите Новый эксперимент от шаблона, выберите Применить шаблон Pre-Defined.
- Как теперь программа спросит, какие виды для отслеживания, выберите рыбы. Используйте раскрывающийся список для выбора либо Личинки данио рерио Данио рерио взрослого зависимости экспериментальная парадигма.
- Настройка аренах, в которых будут отслеживаться каждого животного. Для личинок выберите хорошо пластины, круглые хорошо и Шаблон зоны нет. Для взрослых используйте открытые поля, площадь с Шаблон зоны нет. Затем определите правильное количество Аренас, один для каждого животного, отслеживаемых в видео.
- Выберите модель для оптимального отслеживания, нажмите на трек центр точка, и будьте уверены, что животных цвет выбран быть темнее фона. Применить частоту, на которой была приобретена видео. Программное обеспечение для отслеживания должна автоматически обнаружить это.
- Нарисуйте масштаба для калибровки реальных расстояние объекта для точного определения двигательного поведения рыбы с помощью Параметров Арена.
- Редактировать Аренас, чтобы убедиться, что весь район, что рыба будет отслеживаться; в противном случае образцы будут потеряны во время приобретения.
Примечание: Будьте внимательны при создании областей. Личинок рыб особенно чувствительны к отслеживания ошибки, если арены либо слишком больших или малых. Плохое освещение в эксперименте можно также создавать тени на стенах хорошо пластины, которые программа может думать, это животное, создавая ложный положительный. - Щелкните Дополнительно. Метод Обнаружения параметравыберите Динамический вычитание, а затем нажмите на фоне и выберите Начать обучение. Отрегулируйте темные контраст соотношение сигнал/шум до животные хорошо отслеживаются, и фон не вызывает отслеживания, чтобы прыгать.
Примечание: Качество видео может варьироваться от экспериментов, так что каждое судебное разбирательство может понадобиться использовать различные параметры, соответственно. С помощью функции Контур тема и Тема размер может значительно улучшить результаты отслеживания. - Выберите список суда и загрузить соответствующие параметры до начала записывать данные в программу.
- Нажмите на вкладку приобретение , Трек все запланированные испытания и нажать на кнопку записи.
- Анализ профиляубедитесь, расстояния и времени движения выбраны.
Примечание: В порядке для последующего анализа сна важно, что эти настройки верны, как .perl файл должен читать эти данные в правильном порядке для расчета сна. - В группе Экспорт выберите Необработанных данных, экспортировать данные в формате Юникод.
5. Отслеживание социально размещены рыбы
- Выполните шаги 4.1-4.4 для настройки эксперимента в отслеживания программного обеспечения.
- В раскрывающемся меню выберите сколько животных для отслеживания для эксперимента.
- В настройках Арена Нарисуйте правильный масштаб для калибровки расстояние реального мира.
- В параметры обнаружения использовать Динамические вычитание, а темные контраст лучше отслеживать животного.
- Отрегулируйте размер предмет под параметры обнаружения, так что отслеживается только очень небольшая часть животного.
Примечание: Отслеживая только небольшая часть животного, это уменьшит количество переключения между животными, когда они пересекаются пути во время приобретения. - Как только треки будут приобретены, используйте Редактор трасс вручную исправить раз где рыбы могут пересекать пути.
6. Извлечение данных сна от двигательной активности
Примечание: Поведенческое определение сна в личинок и взрослых A. гракл — 1 мин или более из покоя. Это определение было определено с помощью экспериментов порога возбуждения, где требуется больше сенсорные стимулы возбуждать поведенческие реакции в состоянии сна (> 60 s) по сравнению с бодрствования14,17. Для учета мелких движений и дрейфующих общих видов рыб, там применяются пороговые значения скорости для разделения реальное движение от шума или дрейфа. Эти пороговые значения вычислительно производные, сравнивая корреляции между расстоянием и продолжительность сна найти самые высокие значения R-квадрат; Таким образом, определяя наиболее точной скорости движения и сна. Для личинок рыб верхний и нижний пределы оба 12 мм/s как там практически нет дрейфа. Для взрослых рыб нижний предел — 2 см/сек с верхний предел 4 см/с для учета дрейфа.
- Установите Cygwin на анализ компьютер для приведения приговора в исполнение написанные пользовательские скрипты для извлечения опорно-двигательного аппарата и спать поведение.
- Создайте новую папку эксперимент в домашнем каталоге Cygwin.
- Импорт необработанных данных в Юникоде из программного обеспечения отслеживания и выполнения файла .sh в Cygwin с конвертировать кодирование UTF-8, UTF-16.
- Запустите файл .perl в Cygwin для извлечения данных сна.
- Открыть файл макросов и следуйте инструкциям в таблице завершить анализ данных по желанию.
Примечание: Базовый уровень командной строки кодирования будет необходимо осуществить эту часть анализа. Команды общего Linux будет достаточно. Если есть проблемы с программами, читая данные должным образом, проверьте данные отслеживания программного обеспечения в любом свободном текстовом редакторе, чтобы быть уверенным кодировку и порядок является правильным для исполняемых файлов писать правильно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Личинки в возрасте от 4-30 dpf может быть надежно записан в закрытой системе индивидуализированной сборки, описанные на рис. 1. Система включает в себя ИК и видимые освещения для записей в светлых и темных условиях, в различных условиях видимый свет (рис. 1A). Видео затем анализируются с помощью программного обеспечения отслеживания (рис. 1BC) и пост обработаны с помощью пользовательских сна макроса (см. Дополнительные загрузки). Личинок рыб из трех независимых cavefish населения отображения значительное снижение в сна по сравнению с поверхности рыбы (рис. 1 d) и 20 dpf, и эта потеря сна проходит согласованно во всех этапах своего развития. Часто, возраст рыбы, проанализированы для сна зависит от экспериментальных манипуляций. Например а. гракл не потреблять пищу на 4 дня, так что эксперименты, изучение взаимодействий между сна и питания будет обычно происходят в старых личинки25. И наоборот морфолиновая эффективны только в начале Фрай (обычно моложе 4 dpf) поэтому этот возраст для ослов сна24,,2627.
A. гракл может жить до 30 лет в лаборатории, но эксперименты с использованием взрослых обычно выполняются в рыбе, в возрасте от 6 месяцев до 3 лет. Рыбы могут быть записаны в различных размеров бака в зависимости от эксперимента и ИК освещение позволяет для записи в периоды светлых и темных (рис. 2A). Индивидуальные Аренас помечены в отслеживания для отслеживания рыбы, и пост-обработки с использованием пользовательских макросов предоставляет индикация сна (Рисунок 2БC). Сна значительно уменьшается в Pachón, Молино и Tinaja cavefish, по сравнению с поверхности рыбы (Рисунок 2D). Кроме того эта система позволяет для записи нескольких рыб в одном Арена (обычно 10 галлонов), позволяя для анализа как социальных взаимодействий влияет на сон (Рисунок 2EF). Социальное жилье надежно уменьшает сна в поверхности рыбы, не затрагивая сна в Pachón cavefish (рис. 2 g). Отсутствие эффекта в cavefish вероятно из-за эффекта подвал, где cavefish спать мало, особенно на крупных аренах, используется для изучения социального поведения.
Рисунок 1: Запись сна поведение в личинок и несовершеннолетних A. гракл. (A) схема личиночной сна поведение установки: Личинка размещены на платформе в свете контролируемую трубки. Инфракрасные и белый систем освещения сидят ниже рыб в нижней части трубки. ИК перевал камеры сидит в верхней части трубки и подключен к ноутбуку, на котором записано видео. Все питание системы (освещение и ноутбук) подключены к резервного питания. (B) Арена параметры отслеживания программного обеспечения. Отдельные личинки хранятся в скважинах в пластине культуры ткани, и Аренас (голубой) производятся для каждого животного. (C) следы опорно двигательного поведения рыб после приобретения данных отслеживания программного обеспечения. Красные следы представляют 10 s деятельности в 20 - день старые рыбы. (D) результирующий спать данные отслеживания программного обеспечения. Несовершеннолетних cavefish сходятся на сокращение сна поведение, по сравнению с поверхности рыбы морфы (односторонним ANOVA F(3, 116) = 76.12; Для сравнения каждого cavefish населения с поверхности рыбы, P был применен анализ столб hoc Дуннетт < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Взрослый A. гракл система для сна и суточного поведение. (A) диаграмма системы сна запись: рыбы проводятся в цистернах на стойке напротив камеры слежения. Система инфракрасного освещения помещается позади рыбы цистерны, в то время как камеры ИК перевал прикреплены к ноутбук для записи поведение. Все питание системы подключены к системе резервного аккумулятора в случае колебания мощности. (B) Арена настройки отслеживания программного обеспечения. Индивидуальные рыбы отмечены путем создания отдельных Аренас (голубой) для отслеживания двигательного поведения. (C) представитель опорно треков (красные линии) отдельных рыб после приобретения поведенческих записи отслеживания программного обеспечения. Следы представляют 20 s деятельности. (D) продолжительность общий сна более 24 h значительно снижается в три отдельных популяций cavefish, по сравнению с поверхности рыбы (односторонним ANOVA F(3, 106) = 52,66; Дуннетт пост hoc тесты были применены между поверхности рыбы и каждой популяции пещеры, P < 0,001). (E) A один танк, содержащие несколько рыб, в котором одна Арена (оранжевый) производится для отслеживания социальных взаимодействий и сна. (F) опорно следы нескольких рыб после сбора данных отслеживания программного обеспечения, (каждый цвет линии представляет отдельных рыб). (G) репрезентативных данных поверхности и Pachón cavefish в социальной сна отслеживания. Поверхности рыбы значительно уменьшить сна в 10 Л танков, по сравнению с арены 2 Л; Поверхности рыбы сна далее уменьшается, когда рыба социально размещены. Cavefish сна, существенно не изменяется в любом состоянии (двусторонний ANOVA F(2,46) = 4.545; post hoc анализ проводился в рамках каждой популяции для проверки эффекта размер бака и социального состояния сна сингл 10 L, P = 0,013; 10 Л социальной, P = 0.0003). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает пользовательские системы для количественной оценки сна и двигательной активности в личинок и взрослых cavefish. Cavefish появились как ведущих модель для изучения эволюции сна, который может использоваться для изучения генетических и нейронных основу сна положение1. Важнейшие шаги в этом протоколе включают оптимизацию освещения и качество видео для того чтобы обеспечить точное отслеживание, необходимых для количественной оценки сна. Система для сбора и анализа данных, описанных здесь являются полностью функциональными, как много других систем, как коммерческих, так и под заказ, для количественной оценки передвижения и поведение28,29,30. Предыдущий assay изучения сна в одной рыбы может быть продлен для анализа размещены группы рыб. Значительное внимание при неисправностей или проектирование анализов является смешивает социальное поведение может иметь на сон человека. Например агрессия является общим в Астианакт, и уровни агрессии отличаются между поверхности рыбы и cavefish31. Оптимизировать количество рыбы, размер арены и соотношение полов, с тем чтобы свести к минимуму агрессии позволит воспроизводимость измерений регуляции сна.
Ограничением методики, как описано, является отсутствие после отдельных рыб по всему анализ надежности. Автоматизированное отслеживание животных часто переключать животных, когда они вступают в контакт. Эту проблему можно решить путем тщательной оптимизации порогов или вручную исправить какие-либо переключатели. Кроме того система, описанная система не потока через, и таким образом, качество воды может стать проблемой после записи более чем на несколько дней. Другой поток через системы были описаны в zebrafish13 и они легко могут применяться к sty мексиканской cavefish.
Методике, описанной значительным из-за его широкую применимость для измерения поведение в различных рыб. Предстоит еще охарактеризовать в почти любой рыбы морской или пресной воды, включая Sticklebacks, цихлиды, swordtails32,,3334сна. Универсальность этой системы для измерения сна в A. гракл и другие модели рыбы могут решения разнообразных вопросов об эволюции и генетических основ сна. Аппаратное обеспечение, связанных с этой системой является очень выгодным, что делает его очень доступным и предоставление возможности для высокой пропускной способности анализа фармакологических и ecotoxilogical анализ сна и двигательной активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIGMS премии GM127872 ACK, премии 105072 NINDS БОВ и ACK и NSF награду 1656574 ACK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
References
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J.
- Allada, R., Siegel, J. M.
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B.
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti,, Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, Oxford University Press. Available from: http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1 (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
