단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Summary

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

Abstract

셀 proteomes 전기 이동 법 분석 실험, 세포에 있는 단백질의 모든 종 형광 염료와 레이블이 아닌 구체적으로 하 고 그들의 분리에 따라 매칭에 의해 발견을 사용 하 여 특징. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 분자 시각화 능력 磁 단백질 검출을 제공할 수 있다. 그러나, 전기 이동 법 분석 실험에이 강력한 이미징 방법의 응용은 프로테옴 걸쳐 각 단백질의 형광 라벨의 동질성을 특성화 하는 방법의 부족에 의해 방해 된다. 여기, 우리는 단일 분자 형광 이미징 분석 결과에 따라 프로테옴 걸쳐 라벨 동질성을 평가 하는 방법을 개발 했다. 헬러 세포 샘플, 우리는 ‘라벨 인’ 되 나 적어도 하나의 염료와 함께 표시 하는 단백질의 비율을 사용 하 여 측정에서 (LO), 결정 되었다 범위를 50%에서 90%, 단일 분자 이미징에 응용 프로그램의 높은 잠재력을 지 원하는 민감하고 정확한 프로테옴 분석입니다.

Introduction

프로테옴 분석, 셀에 표시 하는 단백질 분자의 전체 집합을 계량 하는 것을 목표로, 현재 생물의 약 연구에 귀중 한 접근 이다. 이 분석은 일반적으로 단백질 종 단백질 이온화^1,2,3를 통해 생성 된 스펙트럼에 따라 식별 하는 질량 분석에 의존 합니다. 프로테옴 분석에 대 한 대체 방법 이며 전기 이동 법, polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 포함 하 여, 모 세관 전기 이동 법 2 차원 (2D) 젤 전기 이동 법. 이 방법은 일반적인 전기 이동 별거 및 탐지 및 정량화 각 단백질의 분석 된 셀에서 모든 단백질 분자의 형광 라벨에 의존 합니다. 달성 하기 위해 필요한 일반적인 단백질 라벨, 하나의 전략 Coomassie Blue와 Sypro-루비^{4,5,6 등 정전기 및 소수 성 상호 작용을 통해 단백질을 바인딩할 수 있는 형광 염료를 사용 하는} . N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르 또는 maleimide, 1 차 아민 및 thiols와 같은 일반적인 잔류물을 통해 단백질에 묶는 covalently 수 있습니다, 각각^7, 를 포함 하는 염료와 화학식 라벨을 사용 하는 대체 전략은 ⁸.

한편, 형광 검출의 감도 낮은 풍부한 단백질 및 세포의 작은 숫자 분석에 이상적입니다. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 염료와 생체 외와 생체 조건^{9,10,,1112, 레이블이 지정 된 단백질의 검출을 허용 하는 가장 중요 한 방법 중 하나는 13,,1415}. 응용 프로그램 이미징이 방법의 전기 기반 프로테옴 분석을 개별 붙일 표시 된 단백질을 계산 하 여 매우 민감하고 양적 분석을 사용 예정입니다. 그러나, 남아 있다 불분명 여부 형광 염료로 충분히 균질에 걸쳐 모든 단백질 분자 이며 어떻게이 동질성 다른 단백질 종 (그림 1)에 의해 영향을 받습니다. 간단한 대량 솔루션 측정 ‘커플링 효율’⁸ 또는 ‘효율 라벨’ 라는 단백질에 형광 염료의 어 금 니 비율을 얻기 위해 사용할 수 있지만이 속성 중 라벨의 동질성에 정보를 제공 하지 않습니다. 단백질 분자입니다.

여기, 우리는 라벨 동질성¹⁶셀 (그림 2) 모든 단백질 종에 대 한 조사 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 분석 결과의 두 가지 주요 단계는 단백질 정화 및 이미징. 첫 번째 단계에서 셀에 모든 단백질은 붙일 표시 하 고 biotinylated, 다음 별도로 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 압축을 푼 뒤에 electroelution. 두 번째 단계에서 추출 된 표본에서 개별 단백질 분자의 형광 속성 단일 분자 이미징에 따라 평가 됩니다. 우리가 라벨 인 (LO)¹⁶, 전화와 형광 염료의 평균 수는 단일 단백질 분자에 바인딩된는이 데이터를 매개 변수 계산 분석에 대 한 중요 한 단백질의 비율 이라고 적어도 한 같은 염색 (n̄ _염료), 특성화 될 수 있습니다. 프로토콜, NHS 에스테 르 기반 Cyanine 3 (Cy3) 염료와 HeLa 세포 프로테옴을 라벨에 대 한 최적화 절차를 예를 들어, 제시 하 고 원하는 연구 목표에 따라 다른 레이블 프로시저를 수정할 수 있습니다.

Protocol

1. 세포 준비 37 ° C에서 10 cm 접시에 HeLa 세포 배양 미만 5% CO2 Dulbecco의 수정 10% 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 글의 중간. 그들은 70 %confluency, ATCC 지침17다음에 도달 되 면 기 하 급수적으로 성장 세포를 수집 합니다. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (pH 7.4) x 1의 5 mL로 세포를 씻어. PBS를 제거 합니다. 0.1% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL를 추?…

Representative Results

그림 4 는 긍정적이 고 부정적인 제어 뿐 아니라 HeLa 세포, lysate에서 단백질의 다른 분자량 분수에 대 한 원시 이미지 데이터를 나타냅니다. 단백질 견본 및 긍정적인 이미지 당 100-500 전시 명소를 제어 하는 동안 부정적인 컨트롤 없음 또는 프로토콜 충분히 coverslip 표면에 염료의 일반적인 바인딩을 억제를 보여주는 몇 가지 관광 명소를 표시 합니다….

Discussion

이 문서는 SDS 페이지 (3 단계)와 분리 후 셀에 각 레이블이 단백질 종의 라벨 동질성을 계량 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분리 방법 분리 및 특수 장비²³을 요구 하면서 높은 해상도, 세포질 단백질의 분류를 허용 하는 모 세관 전기 이동 법, 액체 크로마토그래피 등 다른 방법으로 교체하실 수 있습니다. 현재 프로토콜에 NHS 에스테 르를 사용 하 여 라벨 메서드 예 maleimide-에스테 …

Materials

22x22x0.15 mm coverslip	VWR	470019-004
488 nm Argon laser	Coherent	Innova 70C
488 nm dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03
488 nm emission filter	Semrock	FF02-520/28
560 nm dichroic filter	Semrock	Di02-R561
560 nm emission filter	Semrock	FF02-617/73
560 nm fiber laser	MBP Communications	F-04306-2
60x oil immersion lens	Olympus	PLAPON 60x
Avidin	Nacalai-tesque	03553-64
Biotin-PEG-amine	Thermo Scientific	21346
Biotinylated Alexa Fluor 488	Nanocs
Borate	Nacalai-tesque
BSA	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-ester dye	GE Healthcare	PA13101
Dialyzer  – D-tube, 6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	Sigma-Aldrich
DTT	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD camera	Andor	IiXon 897
Epi fluorescence microscope	Olympus	IX81
Gel viewer	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix	Gibco
Plasma cleaner	Diener Electronic
SDS	Wako	NC0792960
Size purification column 10K	Merck Millipore	UFC5010
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416