우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
재조합 형 바이러스를 사용 하 여 기본 또는 적용 바이러스학에 중요 한 되고있다. 역 유전학 둘 다 바이러스 성 복제 메커니즘을 해독 하 고 antivirals 연구 개발 플랫폼을 제공 하는 백신에 대 한 매우 강력한 기술 될 입증 되었습니다. 그러나 건설 및 부정적인 물가 RNA 바이러스 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 역방향 유전자 시스템의 조작, 섬세 한 남아 있고 특별 한 노하우를 필요로 합니다. RSV 게놈은 약 15 kb는 모두 바이러스 성 RNA 복제 및 전송에 대 한 서식 파일의 단일 스트랜드, 부정 감지 RNA 이다. 우리의 역 유전학 시스템 인간의 RSV 긴 긴장 게놈 (HRSV)의 cDNA 사본을 사용합니다. 이 cDNA, 뿐만 아니라 cDNAs 바이러스 성 단백질의 중 합 효소 복잡 한 인코딩 (L, P, N 및 m 2-1) 개별 식 벡터 T7 중 합 효소 컨트롤 시퀀스 아래에 배치 됩니다. T7 중 합 효소는 안정적으로 표현, BSR-T7/5 셀에 이러한 요소의 transfection 세포질 복제와 재조합 RSV의 전사 유전자 변형된 virions를 야 기한 있습니다. BSRT7/5의 문화 상쾌한와 세포 표면에는, 새로운 RSV 감염 바이러스 성 확대를 위한 인간 형 간염-2 셀에 수집 됩니다. 증폭의 2 개 또는 3 라운드 1 x 106 1 x 107 플 라크 형성 단위 (PFU)를 포함 하는 바이러스 성 주식을 얻기 위해 필요 / mL. 최적의 수확, 냉동, 및 바이러스 성 주식의 적정 방법 자세히 여기 설명 합니다. 우리 무료 녹색 형광 단백질 (GFP) (RSV-GFP)를 표현 하는 각각 두 개의 재조합 형 바이러스를 만들어 여기에 제시 된 프로토콜을 설명 하거나 바이러스 M2-1 융합 GFP (RSV-M2-1-GFP). 우리 RSV-GFP를 사용 하 여 계량 RSV 복제와 RSV-M2-1-GFP 비디오 현미경 검사 법 기술을 사용 하 여 살아있는 세포에서 바이러스 성 단백질 역동성 뿐 아니라 바이러스 성 구조를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.
서론
인간의 RSV 유아 전세계1급성 호흡기 감염에 대 한 입원의 주요 원인입니다. 또한, RSV 성인 입원 및 사망 부담 노인2의 대부분과 인플루엔자에 비해 상당한 질병 부담으로 연결 됩니다. 있습니다 없습니다 백신 또는 특정 antivirals RSV에 대 한 약속 하지만 아직 신약 개발3,4에 있습니다. 복잡성과 RSV 곱셈의 정량화 기법의 무 거 움 antivirals 또는 현재 상당한 노력에도 불구 하 고 백신에 대 한 검색을 방해. 생체 외에서 RSV 곱셈의 정량화 분석 실험, 양적 현미경 검사 법, immunostaining, 플 라크 감소 cytopathic 효과의 분석에서 주로 구성 되어 힘 드는 시간과 비싼 방법에 따라 일반적으로 역전사 (qRT)-연쇄 반응 (PCR), 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 테스트. 수정 된 유전자와 같은 기자 유전자 표현 바이러스는 GFP 코딩, 같은 검 진을 위해 더 적당 한. 자동된 판 독자를 사용 하 여 결합, 기자 재조합 바이러스 유전자를 운반 할 수 있습니다 이러한 분석 표준화 및 높은 처리량을 위해 더 적당 한.
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프로토콜
1. 재료 준비
- 세포 미디어 구매 (감소 된 혈 청 미디어, 최소 필수 미디어 [메모리] 메모리, 그리고 Dulbecco x 10의 수정이 글의 중간 [DMEM]) transfection 시 약 및 미정 질 셀 루 로스 ( 재료의 표참조).
- 반전 유전학에 대 한 다음 벡터를 얻기: 게놈 vector(s) 및 인코딩 N 단백질 및 중 합 효소 복잡 한 단백질 식 벡터. 게놈 벡터 포함 살 균 소 T7 RNA 중 합 효소 (pol T7) 발기인에서 전체 cDNA 게놈 RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) 하류와 RSV-GFP (p-RSV-GFP)의. 식 벡터 (p로 지정-N, p-P, p-L, 및 p-M2-1) 포함 N, P, L, 또는 m 2-1의 코딩 순서를 다운스트림 T7 폴 (Rincheval 외.12 및 플라스 미드 구문에 관한 자세한 내용은 Rameix Welti 외.21 참조).
- 무 균 환경에서 세포 배양과 transfection 및 감염에 대 한 미디어를 준비 합니다. DMEM를 사용 하 여 2 m L-글루타민 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1000 단위/mL 페니실린과 1 mg/mL ....
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결과
이 작품에서 우리는 (그림 2) 형광 단백질을 표현 하는 재조합 RSV 바이러스를 생산 하는 상세한 프로토콜을 설명. PRSV-GFP, GFP 유전자가 이전에 게시 작업21벚꽃 유전자에 대 한 설명 된 대로 P와 M 유전자 사이 도입 되었다. pRSV-M2-1-GFP, M2 유전자가 온전히 남아 그리고 SH와 G 유전자12사이 삽입 했다 M2-1-GFP에 대 한 추가 유전자 코딩. BSRT7/5 셀, 바이러스의 구조에 해당 하는 첫 번째 단계는 그림 2A에 표시 됩니다. 녹색 형광 세포의 작은 클러스터 RSV GFP와 RSV-M2-1-GFP 구조에 해당 하는 우물에서 보이는 72 h posttransfection 했다. 형광 신호 세포질에 GFP RSV 감염 된 세포에서 핵 무료 .......
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토론
여기 선물이 5 플라스 미드에서 재조합 RSVs의 구조 하는 방법 및 그들의 증폭. 바이러스의 게놈을 조작 하는 기능 돌연변이 테스트 하 고 추가 유전자 또는 태그 바이러스 성 단백질을 표현 하는 바이러스학 연구를 혁명을 했다. RSV 우리 설명 하 고이 문서에서는 예를 들어 바이러스 취재 원 유전자, RSV-GFP (미 발표)와 M2-1 단백질 GFP 태그12에 융합 하는 표현으로 사용. RSV 구조 도전 이며 실천을 요구 한다. Transfection 효율은 transfection 시 약의 현명한 선택과 transfection 프로토콜의 이전 최적화에 따라 중요 합니다. 바이러스 성 cDNA는 다운스트림 T7 pol 발기인에에서 배치 역 유전자 벡터의 대부분 때문에 살 균 소 T7 폴을 표현 하는 셀의 사용은 필수. 대신은 vaccinia 바이러스 도우미에서에서 T7 폴을 표현 하는 것입니다. 그러나, T7 유류를 안정적으로 표현 하는 셀의 사용 두 바이러스 분리의 필요성을 방지 하.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 AZD4316 마약을 제공 하는 아 스 트 라 R & D, 석사, 미국 보스톤, 박사 진 유 감사 합니다. 저자는 Cymages 플랫폼 ScanR 올림푸스 현미경에 대 한 액세스에 대 한 감사는 의해 지원 되었다 지역 Ile-de-France (희미 한 상태)에서 부여 합니다. 저자는 INSERM과 베 르 사 이유 Saint-Quentin 대학에서 지원을 인정 한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 35 mm µ 라이브 셀 이미징용 접시 | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 Avicels | 에 대한 기술 및 기타 정보는 http://www.fmcbiopolymer.com 에서 확인할 수 있습니다. 실온에서 보관하십시오. 4단계의 프로토콜은 이 시약에 최적화되어 있습니다. |
| BSRT7/5 | 상용화되지 않음 | 참조 22를 참조하십시오. Buchholz et al. 1999 | |
| 크리스탈 바이올렛 용액 | 시그마 | HT90132 | |
| 관측용 형광 현미경 | Olympus | IX73 올림푸스 현미경 | |
| 비디오 현미경 | ScanR | 올림푸스 현미경 | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥ 99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-글루타민(200m) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 리포펙타민 2000 시약 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | 프로토콜 2.3.이 이 시약에 최적화되어 있습니다. |
| MEM (10x), 글루타민 없음 | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX 보충제 | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥ 99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I 환원 혈청 매체 | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| 파라포름알데히드 수용액, 32%, EM 등급 | 전자 현미경 과학 | 15714 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 플라스미드는 | 상업적으로 이용 가능 | 하지 않습니다.참조 21를 참조하십시오. Rameix-Welti et al. 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 | SMARTpool 및 Dharmacon에서 설계한 4개의 개별 siRNA 중 3개. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 | Dharmacon. 개별 참고 문헌 및 서열 J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: 아그구카아우카카아아우우; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU 및 UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA 형질주입 시약 | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | 프로토콜 5.1단계 및 5.1.2단계는 이 시약에 최적화되어 있습니다. |
| 중탄산나트륨 7.5% 용액 | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| 분광형광계 | Tecan Tecan | 무한 M200PRO |
참고문헌
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.
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재인쇄 및 허가
