Summary

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

Published: July 24, 2019
doi:

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Abstract

נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך דינמי שבו הופעל לאחרונה תאי גזע עצביים (NSCs) באזור תת-החוליות (sgz) של פיתול כישור מבית (DG) ליצור נוירונים חדשים, אשר משתלבים לתוך המעגל העצבי הקיים ולתרום פונקציות היפוקאמאל ספציפיים . חשוב מכך, נוירוגנזה מבוגרת היא רגישה מאוד לגירויים סביבתיים, המאפשרת רגולציה תלוית הפעילות של פונקציות קוגניטיביות שונות. מגוון רחב של מעגלים עצביים מאזורי מוח שונים מתזמרים פונקציות קוגניטיביות מורכבות אלה. לכן חשוב להבין כיצד מעגלים עצביים ספציפיים לווסת נוירוגנזה למבוגרים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתמרן פעילות המעגל העצבי באמצעות קולטן מעצב מופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) טכנולוגיה המסדיר NSCs ו צאצאי היילוד במכרסמים. פרוטוקול מקיף זה כולל הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראליים, גירוי גנטי כימוע של מעגלים עצביים ספציפיים, מינהל אנלוגי של תימידין, עיבוד רקמות, מimmunofluorescence תיוג, הדמיה מיקוד, והדמיה ניתוח של בשלבים שונים של תאים מקודמי העצבי. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות על טכניקות אחזור אנטיגן המשמש להמחיש NSCs וצאצהם ומתאר פשוט, דרך יעילה עדיין לווסת את מעגלי המוח באמצעות קלוזאפין N-תחמוצת (cno) או cno-המכיל מי שתייה ו וירוסים בהבעת הדרדים. החוזק של פרוטוקול זה טמון ביכולת הסתגלות שלה ללמוד מגוון רחב של מעגלים עצביים המשפיעים על נוירוגנזה מבוגרת נגזר מ NSCs.

Introduction

נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך ביולוגי שדרכו הנוירונים החדשים נולדים במבוגר ומשולבים לתוך הרשתות העצביות הקיימות1. בבני אדם, תהליך זה מתרחש בפיתול הדנאט (DG) של ההיפוקמפוס, שם כ-1,400 תאים חדשים נולדים כל יום2. תאים אלה נמצאים בחלק הפנימי של ה-DG, אשר הנמלים נישה נוירוגניים, כינה את האזור התת בגרגרים (SGZ). כאן, תאי גזע עצביים מבוגרים (NSCs) עוברים תהליך התפתחותי מורכב כדי להפוך נוירונים תפקודית לחלוטין כי לתרום לוויסות של פונקציות המוח ספציפיים, כולל למידה וזיכרון, רגולציה מצב הרוח, ואת תגובת הלחץ3 ,4,5,6. כדי להשפיע על התנהגויות, מבוגר NSCs מוסדר ביותר על ידי גירויים חיצוניים שונים באופן התלוי בפעילות על ידי תגובה למערך של רמזים מקומיים וכימיים. הסימנים הכימיים הללו כוללים נוירוטרנסמיטורים ונוירומודולטורים ופועלים באופן מעגלי מאזורי מוח שונים. חשוב מכך, התכנסות מעגל רחב של רמזים כימיים אלה על NSCs מאפשר רגולציה ייחודית ומדויקת של הפעלת תא גזע, בידול, והחלטות הגורל.

אחת הדרכים האפקטיביות ביותר לחקור את הרגולציה בוויסות של NSCs למבוגרים בvivo היא על ידי שיוך ניתוח מערכתית של מניפולציות במעגל רחב. Immunofluorescence ניתוח של למבוגרים NSCs היא טכניקה מנוצל בדרך כלל, שבו נוגדנים נגד סמנים מולקולריים ספציפיים משמשים כדי לציין את השלב ההתפתחותי של למבוגרים NSCs. סמנים אלה כוללים: nestin כמו תא הרדיאלי של גליה וסמן קדמון מוקדם של העצב, Tbr2 כסמן מחולל קדמון ביניים, ו dcx כמו הסמן הישן והלא בוגר תא מטרה7. בנוסף, על-ידי ניהול האנלוגיות של תימידין כגון brdu, cidu, idu, ו-Edu, אוכלוסיות תאים שעברו שלב S יכול להיות מתויג בנפרד ודמיינו8,9,10. על-ידי שילוב שתי הגישות הללו, ניתן לחקור מגוון רחב של שאלות החל מאופן ההפצה המוסדר בשלבים התפתחותיים ספציפיים, לגבי האופן שבו סימנים שונים משפיעים על בידול המועצה לבטחון לאומי ועל נוירוגנזה.

מספר אפשרויות קיימות כדי לטפל ביעילות במעגלים עצביים כולל גירוי חשמלי, אלקטרואופטיקה, וכימוסגנטיקה, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלהם. גירוי חשמלי כרוך בניתוח נרחב שבו אלקטרודות מושתלים לאזור המוח מסוים אשר משמשים מאוחר יותר כדי לשדר אותות חשמליים לווסת את אזור המוח המיועד. עם זאת, גישה זו חסרה גם הסלולר וגם המעגלים. אלקטרואופטיקה כרוכה במסירת חלקיקים ויראליים לקודד קולטן המופעל אור כי הוא מגורה על ידי לייזר הנפלט באמצעות סיבים אופטיים מושתל, אבל דורש מניפולציות נרחבות, עלות גדולה, ניתוחים מורכבים11. כימוקוטיקה כרוכה במסירת חלקיקים ויראליים המקודדים קולטן מעצב המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים או ראסטות, אשר מופעלים לאחר מכן על ידי מסוים ומבחינה ביולוגית המכונה קלוזאפין N-תחמוצת (cno)12 . היתרון של ניצול ראסטות לתמרן מעגלים עצביים מקומיים המסדירים למבוגרים NSCs שקרים בקלות ומסלולים שונים של הממשל CNO. זה מאפשר גישה פחות זמן רב עם טיפול בעלי חיים מופחתת, אשר ניתנת להתאמה בקלות למחקרים ארוכי טווח לווסת את המעגלים העצביים.

הגישה המתוארת בפרוטוקול זה היא אוסף מקיף של פרוטוקולים שונים הנדרשים לחקור בהצלחה את הרגולציה של היפוקמאל נוירוגנזה למבוגרים המשלבת הן שיטות immunofluorescence ומניפולציות מעגלים באמצעות כימוטיקה. השיטה המתוארת בפרוטוקול הבא מתאימה לעירור או לעיכוב של מעגלים אחד או מספר בו בvivo כדי לקבוע את התפקוד הרגולטורי שלהם על נוירוגנזה מבוגרת. גישה זו משמשת במידה הטובה ביותר אם השאלה אינה זקוקה לרזולוציה גבוהה של הזמן. שאלות הדורשות שליטה טמפורלית מדויקת של גירוי/עיכוב בתדר מסוים, יכולה להיות ממוענת טוב יותר באמצעות אלקטרואופטיקה13,14. הגישה המתוארת כאן מותאמת בקלות למחקרים ארוכי טווח עם טיפול בבעלי חיים מינימלי במיוחד כאשר המתח הוא דאגה עיקרית.

Protocol

כל ההליכים כולל נושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה היל. 1. הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראליים . קבע את המעגלים העצביים האלה זה יקבע את הווירוס ואת קו העכבר מנוצל עבור ההליך הבא.הערה: בדוגמה זו, התחז?…

Representative Results

בעקבות ההליכים הניסיוניים שתוארו לעיל (איור 1A,B), הצלחנו לקבוע את ההשפעות של עירור התחזיות תא מוסי הצלעות על הנישה הנוירוגניים בתוך ההיפוקמפוס. על-ידי ניצול של היצורים התלויים ביצור-מצמידים וירוס המגרה בשילוב עם מכשיר הקשר של תא מוסי 5-HT2A-קו, היינו מסוגלים באופן סלק…

Discussion

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך כיצד מניפולציה מעגלים עצביים ספציפיים מסדיר נוירוגנזה היפוקאמאל למבוגרים בvivo באמצעות סדרה של טכניקות אימונוהיסטוכימיה. שיטה התלויה בוויסות הפעילות של בוגרים נוירוגנזה באמצעות מעגלים עצביים ספציפיים היא טכניקה רבת ערך עם פוטנציאל רב לשינויים לחקר מגוון ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.J.Q. היה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת התוספת גיוון R01MH111773, כמו גם מענק הכשרה T32 T32NS007431-20. פרויקט זה נתמך ממענקים הוענק ל-י. ס. י. מ-NIH (MH111773, AG058160, ו NS104530).

Materials

24 Well Plate Thermo Fisher Scientific 07-200-84
48 Well Plate Denville Scientific T1049
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) Carbosynth NE08701
Alcohol 70% Isopropyl Thermo Fisher Scientific 64-17-5
Alcohol Prep Pads Thermo Fisher Scientific 13-680-63
Alexa-488 Azide Thermo Fisher Scientific A10266
Anti-Chicken Nestin Aves NES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCX Santa Cruz Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Mouse Tbr2 Thermo Fisher Scientific 14-4875-82; RRID: AB_11042577
Betadine Solution (povidone-iodine) Amazon
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) Sigma-Aldrich 251275
Clozapine N- Oxide Sigma-Aldrich C08352-5MG
Confocal Software (Zen Black) Zeiss Microscopy Zen 2.3 SP1 FP1 (black)
Copper (II) Sulfate Pentahydrate Thermo Fisher Scientific AC197722500
Cotton Swabs Amazon
Coverslip Denville Scientific M1100-02
Delicate Task Wipe Kimwipes Kimtech Science 7557
Drill Bit .5mm Fine Science Tools 19007-05
Ethylene Glycol Thermo Fisher Scientific E178-1
Hamilton Needle 2 inch Hmailton Company 7803-05
Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN Hmailton Company Ref: 87931
High Speed Drill Foredom 1474
Infusion Pump Harvard Apparatus 70-4511
Injectable Saline Solution Mountainside Health Care NDC 0409-4888-20
Insulin Syringe BD Ultra-Fine Insulin Syringes
Isoflurane Henry Schein 29405
Stereotax For Small Animal KOPF Instruments Model 942
Leica M80 Leica
Leica Microtome Leica SM2010 R
LSM 780 Zeiss Microscopy
Nair (Hair Removal Product) Nair
Paraformaldahyde 4% Sigma-Aldrich 158127
Plus Charged Slide Denville Scientific M1021
Phosphate Buffered Solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010031
Puralube Vet Ointment Puralube
Slide Rack 20 slide unit Electron Microscopy Science 70312-24
Slide Rack holder Electron Microscopy Science 70312-25
Small Animal Heating Pad K&H
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Super PAP Pen 4 mm tip PolySciences 24230
Surgical Scalpel MedPride 47121
Tris Buffered Solution (TBS) Sigma-Aldrich T5912
Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) Sigma-Aldrich C8532
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Tweezers Amazon
Vet Bond Tissue Adhesive 3M 1469SB

References

  1. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
  2. Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
  3. Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
  4. Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
  5. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
  6. Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
  7. Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
  8. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
  9. Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
  10. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  13. Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
  16. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
  17. Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  18. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  19. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
  20. Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
  21. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
  22. Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  23. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
  24. Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).

Play Video

Cite This Article
Quintanilla, L. J., Yeh, C., Bao, H., Catavero, C., Song, J. Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59237, doi:10.3791/59237 (2019).

View Video