Régulation spécifique du circuit d'analyse des cellules neuronales neuronales hippocampales adultes
Summary
Le but de ce protocole est de décrire une approche pour analyser le comportement des cellules neurales adultes de tige/progéniteur en réponse à la manipulation chimiogénétique d’un circuit neural local spécifique.
Abstract
La neurogenèse adulte est un processus dynamique par lequel les cellules souches neurales nouvellement activées (NSC) dans la zone subgranulaire (SGZ) du gyrus denté (DG) génèrent de nouveaux neurones, qui s’intègrent dans un circuit neuronal existant et contribuent à des fonctions hippocampales spécifiques . Fait important, la neurogenèse adulte est très sensible aux stimuli environnementaux, ce qui permet une régulation dépendante de l’activité de diverses fonctions cognitives. Une vaste gamme de circuits neuronaux de diverses régions du cerveau orchestre ces fonctions cognitives complexes. Il est donc important de comprendre comment des circuits neuronaux spécifiques régulent la neurogenèse adulte. Ici, nous décrivons un protocole pour manipuler l’activité de circuit neural utilisant le récepteur de concepteur exclusivement activé par la technologie de drogues de concepteur (DREADDs) qui règle des NSC s’est néréiade et la progéniture nouveau-née chez les rongeurs. Ce protocole complet inclut l’injection stéréotaxique des particules virales, la stimulation chimiogénétique des circuits neuronaux spécifiques, l’administration analogique de thymidine, le traitement de tissu, l’étiquetage d’immunofluorescence, l’imagerie confocale, et l’imagerie l’analyse de divers stades des cellules précurseurs neuronales. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur les techniques de récupération d’antigènes utilisées pour visualiser les CNS et leur progéniture et décrit un moyen simple, mais efficace, de moduler les circuits cérébraux à l’aide de l’oxyde de clozapine N (CNO) ou de l’eau potable contenant du CNO et Virus exprimant des DREADDs. La force de ce protocole réside dans son adaptabilité à étudier une gamme variée de circuits neuronaux qui influencent la neurogenèse adulte dérivée des CNS.
Introduction
La neurogenèse adulte est un processus biologique par lequel de nouveaux neurones naissent chez un adulte et s’intègrent dans les réseaux neuronaux existants1. Chez l’homme, ce processus se produit dans le gyrus denté (DG) de l’hippocampe, où environ 1.400 nouvelles cellules naissent chaque jour2. Ces cellules résident dans la partie intérieure de la DG, qui abrite une niche neurogène, appelée zone sous-granulaire (SGZ). Ici, les cellules souches neurales adultes hippocampal (NSC) subissent un processus développemental complexe pour devenir des neurones entièrement fonctionnels qui contribuent à la régulation des fonctions spécifiques de cerveau, y compris l’apprentissage et la mémoire, la régulation d’humeur, et la réponse d’effort3 ,4,5,6. Pour influencer les comportements, les NSC adultes sont fortement réglementés par divers stimuli externes d’une manière dépendante de l’activité en répondant à un éventail de signaux chimiques locaux et distal. Ces indices chimiques comprennent les neurotransmetteurs et les neuromodulateurs et agissent d’une manière spécifique de circuit de diverses régions du cerveau. Fait important, la large convergence de ces indices chimiques sur les CNS permet une régulation unique et précise de l’activation des cellules souches, de la différenciation et des décisions relatives au sort.
L’un des moyens les plus efficaces d’interroger la régulation des circuits des CNS adultes in vivo est de jumeler l’analyse de l’immunofluorescence avec des manipulations à l’échelle du circuit. L’analyse d’immunofluorescence des CNS adultes est une technique couramment utilisée, où des anticorps contre des marqueurs moléculaires spécifiques sont utilisés pour indiquer le stade de développement des CNS adultes. Ces marqueurs incluent : nestin comme cellule de glia le radiale et marqueur neural tôt d’ancêtre, Tbr2 comme marqueur intermédiaire d’ancêtre, et dcx comme marqueur de neuroblaste et immaturedeneurone 7. En outre, en administrant des analogues thymidine tels que BrdU, CidU, Idu, et Edu, les populations cellulaires subissant la phase S peuvent être individuellement étiquetés et visualisés8,9,10. En combinant ces deux approches, un large éventail de questions peuvent être étudiées, allant de la façon dont la prolifération est réglementée à des stades de développement spécifiques, à la façon dont divers indices affectent la différenciation du CNS et la neurogenèse.
Plusieurs options existent pour manipuler efficacement les circuits neuronaux, y compris la stimulation électrique, l’optogénétique et la chimiogénétique, chacun e avec ses propres avantages et inconvénients. La stimulation électrique implique une chirurgie étendue où des électrodes sont implantées à une région spécifique du cerveau qui sont plus tard utilisées pour transmettre des signaux électriques pour moduler une région cérébrale ciblée. Cependant, cette approche manque à la fois de spécificité cellulaire et de circuit. L’optogénétique implique la livraison de particules virales qui codent un récepteur activé par la lumière qui est stimulé par un laser émis par une fibre optique implantée, mais nécessite des manipulations étendues, un coût élevé, et des chirurgies complexes11. La chimiogénétique implique la livraison de particules virales qui codent un récepteur de concepteur exclusivement activé par des médicaments de concepteur ou DREADDs, qui sont ensuite activés par un ligand spécifique et biologiquement inerte connu sous le nom de clozapine N-oxyde (CNO)12 . L’avantage d’utiliser des DREADD s’adressent pour manipuler les circuits neuronaux locaux qui régulent les CNS adultes réside dans la facilité et les différentes voies d’administration du CNO. Cela permet une approche moins longue avec une manipulation réduite des animaux, qui est facilement adaptable pour les études à long terme pour moduler les circuits neuronaux.
L’approche décrite dans ce protocole est une collection complète de divers protocoles requis pour interroger avec succès la régulation de circuit de la neurogenèse hippocampal adulte qui combine des techniques d’immunofluorescence et des manipulations de circuit en chimiogénétique. La méthode décrite dans le protocole suivant est appropriée pour stimuler ou inhiber un ou plusieurs circuits simultanément in vivo pour déterminer leur fonction de régulation sur la neurogenèse adulte. Cette approche est mieux utilisée si la question n’a pas besoin d’un degré élevé de résolution temporelle. Les questions nécessitant un contrôle temporel précis de la stimulation/inhibition à une certaine fréquence, peuvent être mieux traitées en utilisant l’optogénétique13,14. L’approche décrite ici est facilement adaptée pour des études à long terme avec une manipulation minimale des animaux, surtout lorsque le stress est une préoccupation majeure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de ce protocole est d’évaluer comment la manipulation des circuits neuronaux spécifiques régule la neurogenèse hippocampique adulte in vivo à l’aide d’une série de techniques d’immunohistochimie. La régulation dépendante de l’activité de la neurogenèse adulte médiée par des circuits neuronaux spécifiques est une technique précieuse avec un grand potentiel de modifications pour étudier une gamme variée de circuits neuronaux. Le succès de ces types d’expériences dépend de plusieurs facteurs, y com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. a reçu l’appui de l’Institut national de santé mentale des National Institutes of Health dans le cadre du Supplément de diversité R01MH11773 ainsi que d’une subvention de formation T32NS007431-20. Ce projet a été soutenu par des subventions accordées à J.S. par les NIH (MH111773, AG058160 et NS104530).
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
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