Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği
Summary
Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.
Abstract
Yetişkin nörogenezi, dentat girus (DG) ‘ nin subgranüler bölgede (SGZ) yeni aktif nöral kök hücrelerinin (NCIS), mevcut bir nöron devresine entegre olan ve spesifik hipokampel işlevlerine katkı sağlayan dinamik bir süreçtir. . Önemlisi, Yetişkin nörogenezi çevresel uyaranlara son derece duyarlıdır, bu da çeşitli bilişsel işlevlerin faaliyete bağımlı olarak düzenlenmesi için izin verir. Çeşitli beyin bölgelerinden gelen sinir devreleri geniş bir yelpazede bu karmaşık bilişsel fonksiyonları düzenler. Bu nedenle, özel nöral devrelerin yetişkin nörogenezi nasıl düzenleylediğini anlamak önemlidir. Burada, sinirsel devre aktivitesini, NSCs ‘Yi ve yeni doğmuş kemirgenleri düzenleyen tasarımcı ilaçlar (DREADDs) teknolojisi ile özel olarak aktive eden tasarımcı reseptörü kullanarak manipüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kapsamlı protokol, viral partiküllerin stereotaktik enjeksiyonu, spesifik nöral devrelerin kemogenetik stimülasyon, timidin analog yönetim, doku işleme, immünofloresan etiketleme, konfoksal görüntüleme ve görüntüleme içerir. nöral öncü hücrelerin çeşitli aşamalarında analizi. Bu protokol, nscs ve onların kendi kendi kendi onların kendi ve onların onların onların onların onların onların görselleştirmek için kullanılan antijen alma teknikleri hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar ve klozapin N-oksit (CNO) veya CNO içeren içme suyu kullanarak beyin devreleri modüle basit, ama etkili bir yol DREADDs-virüs ifade. Bu protokolün gücü, NSCs ‘den elde edilen yetişkin nörogenezi etkileyen çok çeşitli nöral devrelerin incelenmesi için uyum içinde yatıyor.
Introduction
Yetişkin nörogenezi yeni nöronların bir yetişkinde doğmuş ve mevcut sinir ağları1entegre olan biyolojik bir süreçtir. İnsanlarda, bu süreç Hippocampus dentat girus (DG) oluşur, yaklaşık 1.400 yeni hücreler her gün2doğdu. Bu hücreler, subgranüler bölge (SGZ) olarak adlandırılan, bir nörojenik niş liman DG, iç bölümünde ikamet. Burada, hipokampal yetişkin sinir kök hücreleri (NSCs), öğrenme ve bellek, ruh düzenleme ve stres tepkisi dahil olmak üzere belirli beyin fonksiyonlarının düzenlenmesi için katkıda tam işlevsel nöronlar olmak için karmaşık bir gelişimsel süreç geçmesi3 ,4,5,6. Davranışları etkilemek için, Yetişkin NSCs, yerel ve distal kimyasal ipuçlarını bir dizi yanıt olarak bir aktivite bağımlı şekilde çeşitli dış uyaranlar tarafından son derece düzenlenir. Bu kimyasal ipuçları, nörotransmitter ve nöromodüller içerir ve çeşitli beyin bölgelerinden bir devre belirli bir şekilde hareket. Daha da önemlisi, NSCs üzerindeki bu kimyasal ipuçlarını devre geniş yakınsama kök hücre aktivasyonu, farklılaşma ve kader kararları benzersiz ve kesin düzenleme sağlar.
Yetişkin NSCs in vivo devre düzenlemesi için en etkili yollarından biri, devre geniş manipülasyonları ile immünofluorescence Analizi eşleştirerek olduğunu. Yetişkin NSCs ‘nin immünofloresan analizi, Yetişkin NSCs ‘nin gelişimsel aşamasını göstermek için spesifik moleküler işaretlere karşı antikorların kullanıldığı yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu işaretçiler şunlardır: bir radyal glia hücre ve erken nöral progenitör Marker olarak nestin, bir ara progenitör Marker olarak Tbr2, ve bir Nöroblast ve olgunlaşmamış nöron Marker olarak DCX7. Ayrıca, BrdU, Cidu, IDU ve edu gibi timidin analogları yöneterek, S aşaması geçiren hücre popülasyonları bağımsız olarak etiketli ve8,9,10görselleştirilebilir. Bu iki yaklaşımı birleştirerek, çeşitli ipuçlarını NSC farklılaşma ve nörojenezi nasıl etkilediğini, belirli gelişimsel aşamalarında proliferasyon nasıl düzenlendiği arasında değişen çok sayıda soru araştırılabilir.
Elektrik stimülasyon, optogenetik ve kemogenetik, her biri kendi avantajları ve dezavantajları ile dahil olmak üzere nöral devreleri etkili bir şekilde işlemek için çeşitli seçenekler var. Elektriksel stimülasyon, elektrotların daha sonra hedeflenen bir beyin bölgesini modüe etmek için elektrik sinyallerini iletmek için kullanılan spesifik bir beyin bölgesine implante edildiği kapsamlı bir ameliyatla ilgilidir. Ancak, bu yaklaşım hem hücresel ve devre özgüllüğü yoksun. Optogenetiği, implante edilmiş bir optik liften yayılan bir lazer tarafından uyarılan bir ışık aktif reseptörü kodlayan viral partiküllerin teslim edilmesini içerir, ancak geniş manipülasyon, büyük maliyet ve karmaşık ameliyatlar11gerektirir. Chemogenetics daha sonra özel ve biyolojik olarak inert ligand klozapin N-oksit (CNO)12 olarak bilinen tarafından aktive edilir tasarımcı ilaçlar veya dreadds tarafından aktive bir tasarımcı reseptörü kodlayan viral partiküllerin teslimini içerir . Yetişkin NSCs düzenleyen yerel nöral devreleri işlemek için DREADDs kullanarak avantajı CNO yönetim kolaylığı ve çeşitli yolların yatıyor. Bu da, uzun süreli çalışmalar için nöral devreleri modüe etmek için kolayca adapte olan, azaltılmış hayvan elleçleme ile daha az zaman alıcı bir yaklaşım sağlar.
Bu protokolde açıklanan yaklaşım, hem immünofluoresesans teknikleri hem de devre manipülasyonlarını birleştiren yetişkin hipokampal nörojenezinin devre yönetmeliğini başarıyla sorgulamak için gerekli çeşitli protokollerin kapsamlı bir koleksiyonudur. chemogenetics kullanarak. Aşağıdaki protokolde açıklanan yöntem, Yetişkin nörogenezi üzerinde düzenleyici fonksiyonlarını belirlemek için aynı anda bir veya birden fazla devresi uyarıcı veya inhibe etmek için uygundur. Bu yaklaşım, soru yüksek derecede geçici çözünürlük gerekmiyorsa en iyi şekilde kullanılır. Belirli bir frekans stimülasyon/inhibisyonu hassas temporal kontrol gerektiren sorular, daha iyi optogenetiği kullanarak ele alınabilir13,14. Burada açıklanan yaklaşım, özellikle stres önemli bir sorun olduğu zaman minimal hayvan kullanımı ile uzun vadeli çalışmalar için kolayca adapte edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün amacı, bir dizi immünhistokimya tekniklerini kullanarak özel nöral devrelerin nasıl manipüle edildiğini değerlendirmek. Spesifik nöral devrelerle aracılık edilen yetişkin nörojenezinin aktiviteye bağımlı olarak düzenlenmesi, çeşitli nöral devrelerin incelenmesi için büyük bir potansiyele sahip değerli bir tekniktir. Bu tür deneylerin başarısı, doğru viral teslimat, istenilen manipülasyon için uygun viral seçim, bir timidin analog, hayvan yaşı, immünostasyon verimliliği, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. Ulusal Sağlık Enstitüsü Ruh Sağlığı Ulusal sağlığı Enstitüleri çeşitlilik Supplement R01MH111773 yanı sıra T32 eğitim hibe T32NS007431-20 altında tarafından desteklenmektedir. Bu proje NıH (MH111773, AG058160 ve NS104530) dan js verilen hibe desteklenmektedir.
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
