Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Summary

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato – encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Abstract

A unidade neurovascular (NVU) é composta por células endoteliais microvasculares, formando a barreira hemato – encefálica (BBB), uma membrana basal endotelial com pericitos incorporados, e o limitans glia composta pela membrana basal parenquimatosa e hamartomas final-feed abraçando o aspecto abluminal do microvessels do sistema nervoso central (SNC). Além de manter o CNS homeostase o NVU controla tráfico de células imunes para o CNS. Durante immunosurveillance do SNC baixos números de linfócitos ativados podem atravessar a barreira endotelial sem causar disfunção BBB ou doença clínica. Em contraste, durante neuroinflammation tais como esclerose múltipla ou seu modelo animal encefalomielite auto-imune experimental (EAE) um grande número de células do sistema imunológico pode atravessar o BBB e, posteriormente, o limitans de glia eventualmente alcançando o parênquima do CNS levando a doença clínica. Migração de células imunes para o parênquima do CNS é, portanto, um processo de duas etapas que envolve uma migração sequencial através da barreira endotelial e glia do NVU empregando mecanismos moleculares distintos. Se após a sua passagem através da barreira endotelial, células T encontram seu antígeno cognato em células apresentadoras de perivascular sua reativação local irá iniciar mecanismos subsequentes, levando à ativação focal de gelatinases, que permitirá que as células T para atravessar a barreira glia e insira o parênquima do CNS. Assim, avaliar tanto, permeabilidade BBB e atividade da MMP na correlação espacial ao acúmulo de células imunes no SNC durante EAE permite especificar a perda da integridade das barreiras endoteliais e gliais do NVU. Aqui mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa e como analisar posteriormente permeabilidade BBB in vivo usando uma combinação de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos ainda mais, como Visualizar e localizar gelatinase atividade no cérebro de EAE por zymogaphy in situ, acoplada à imunofluorescência citológicas de membranas de porão do BBB e CD45 + invadindo as células imunes.

Introduction

Sistema nervoso central (SNC) coordena todas as funções mentais em vertebrados e corpo, e homeostase do CNS é essencial para uma comunicação adequada dos neurônios. Homeostase do CNS é garantido pela unidade neurovascular (NVU), que protege o CNS de meio de mudança do fluxo de sangue. O NVU é composto de CNS microvascular em células endoteliais, que são bioquimicamente únicos e estabelecer a barreira hemato – encefálica (BBB) em interferência contínua com pericitos, astrócitos, neurônios e componentes da matriz extracelular (ECM), que estabelece dois membranas de porão distintas¹. A membrana basal endotelial que ensheathes o aspecto abluminal das células endoteliais BBB abriga um número elevado de pericitos e é composto de laminina α4 e α5 laminina, além de outras proteínas de ECM². Em contraste, a membrana basal parenquimatosa consiste de laminina α1 e α2 laminina e é abraçada por hamartomas ponta-pés. A membrana basal parenquimatosa juntamente com os fim de astrocyte-pés compõe o limitans glia que segrega a rede neuronal CNS do líquido cefalorraquidiano preenchido perivascular ou espaços subaracnoideo³. Devido a arquitetura original do NVU, célula imune ao tráfico para o CNS é distinta do que em tecidos periféricos como requer um processo de duas etapas com as células do sistema imunológico, primeiro violar o BBB endotelial e, posteriormente, o limitans glia a fim de alcançar o parênquima do CNS.

Esclerose múltipla (em) é uma doença comum do MPTP do SNC, em que um grande número de células do sistema imunológico em circulação Insira o CNS e causar neuroinflammation, desmielinização e perda focal de integridade BBB⁴. Perda de integridade BBB é uma marca início do MS, conforme indicado pela presença de contraste gadolínio realçando lesões no SNC como visualizado por ressonância magnética (MRI)⁵. Extravasamento de leucócitos para o CNS ocorre ao nível da postcapillary vênulas; no entanto, os precisos mecanismos envolvidos na diapedese de células imunes através da membrana basal do BBB e, posteriormente, a barreira glia permanecem para ser explorado. Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) serve como um modelo animal para MS e tem contribuído significativamente para o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da MS. Por exemplo, usando o modelo de EAE foi descoberto que o extravasamento de leucócitos ocorre em um processo de várias etapas, incluindo uma captura inicial e rolamento passo mediada por selectinas e mucina-como moléculas como ligante de glicoproteína P-selectina (PSGL) -1, seguido de prisão firme integrina-dependente e um rastreamento de células T em células endoteliais BBB aos lados permissivos para diapedese⁶.

Uma vez que as células T cruzaram o BBB endotelial e a membrana basal endotelial, eles precisam encontrar seu cognato antígeno macrófagos ou células dendríticas estrategicamente localizadas nos espaços leptomeníngeo ou perivascular. Essa interação induz a produção focal de mediadores pró-inflamatórios esse gatilho os subsequentes mecanismos necessários para invasão de tecido do CNS de células do sistema imunológico através da glia limitans^7,8,9. Ativação focal de matrix-metaloproteinases (MMP) -2 e MMP-9 altera chemokine ativação e induz a degradação dos receptores de matriz extracelular em astrocyte ponta-pés, que é um pré-requisito para imunológico migração de células através da glia limitans para o Parênquima do CNS e induzir o aparecimento de sintomas clínicos de EAE^10,11.

Combinando a deteção do CNS, infiltrando-se imune celular com BBB escapamento e gelatinase atividade em cortes de tecido do CNS fornece informações valiosas sobre a integridade funcional da barreira endotelial e glia no contexto de neuroinflammation. Por exemplo, recentemente investigamos a perda constitutiva da molécula de adesão endotelial junção apertada molécula (JAM)-B em células imunes ao tráfico para o CNS no contexto da EAE. Comparado ao saudáveis camundongos C57BL/6 de tipo selvagem, saudáveis littermates JAM-B-deficiente mostraram sem comprometimento da integridade do BBB, como demonstrado pela avaliação de permeabilidade in vivo usando marcadores endógenos como exógenos¹². No contexto da EAE, JAM-B-deficientes C57BL/6 ratos mostraram sintomas de doença melhorou, que foi associado com interceptação de células inflamatórias na leptomeníngeo e perivascular espaços¹². Para examinar este fenômeno aplicamos em situ zimografia, permitindo a identificação de gelatinase atividade para testar se a falta de atividade de gelatinase em camundongos JAM-B-deficiente pode ser responsável para o número reduzido de células do sistema imunológico capazes de romper a glia limitans¹².

Dada a disponibilidade de diferentes geneticamente modificada do mouse modelos faltando, por exemplo, moléculas de junção apertada BBB diferentes que podem causar alterações na função do BBB, metodologias para investigar a integridade do BBB são importantes. Além disso, recentemente desenvolvidas drogas poderiam impactar sobre os obstáculos do NVU. Aqui nós mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa com a glicoproteína do oligodendrocyte mielina (MOG)-peptídeo aa35-55 em adjuvantes de Freund completo. Explicamos como localizar infiltração de células imunes em toda as barreiras endoteliais e gliais o NVU e como estudar a integridade da barreira endotelial e gliais in vivo por detecção in situ de marcadores exógenos e atividade de gelatinase, respectivamente.

Protocol

Todos os estudos foram conduzidos sob as diretrizes de acordo com a legislação Suíça relativa à protecção dos animais e foram aprovados pelo Instituto veterinário no Cantão de Berna, Suíça (números de permissão: BE 31/17 e ser 77/18). 1. habitação de camundongos C57BL/6 em condições (SPF) livre de patógeno específico Ciclo de casa os ratos em gaiolas ventiladas individuais com 12/12 h claro-escuro. Providenciar comida e água ad libidum. Para supervisionar a quali…

Representative Results

Avaliação do curso clínico da EAE em camundongos C57BL/6 deve resultar em uma curva de doença, conforme representado na Figura 2A e mudanças no peso do corpo do mouse conforme apresentado na Figura 2B. C57Bl/6 ratos imunizados com MOGaa35-55 geralmente começam a desenvolver sintomas da doença em torno de 10 a 12 dias após a imunização ativa (figura 1A). Normalmente, ratos imunizados mostram uma queda transitória de peso c…

Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir e monitorar EAE em camundongos C57BL/6 fêmeas. As fêmeas são preferencialmente escolhidas, e há uma incidência de mulheres: os homens de 3:1 em MS. Para avaliar a gravidade da EAE, fizemos uso de uma folha de Pontuação de 3 pontos. Severidade da EAE geralmente é marcada em relação a gravidade das disfunções motor. Ratos com avançados estágios da EAE, ou seja, exibir uma pontuação acima de 2 deve ser sacrificado para evitar o sofrimento desnecessário dos animai…

Materials

AMCA anti-rabbit antibody	Jackson ImmunoResearch	111-156-045	Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11)	Pharmingen	07-1401	Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody	DAKO	Z0097	Store at 4 °C
Breeding food	e.g. PROVIMI KLIBA SA	3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III	e.g. Tecniplast	1145T, 1285L
BSA fraction V	Applichem	A1391	Store at 4 °C
Cold gelatine	Sigma-Aldrich	G 9391
Coplin jar + rack	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody	Jackson ImmunoResearch	111-156-144	Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1	e.g. Thermo Scientific	85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)	e.g. Molecular probes	D22910	Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW)	Invitrogen	D3328	Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit	Thermo Fisher Scientific; EnzCheck	E12055	Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)	e.g. Janvier Labs		Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	e.g. Santa Cruz Biotechnology	sc-24648	Store at 4°C
Maintenance food	e.g. PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 peptide	e.g. GenScript		Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus )	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA	e.g. BD	231141	Store at 4 °C
NaCl 0.9 %	B. Braun	3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek )	Sakura	4583
Omnican 50 30G x ½’’	B. Braun	9151125S
Paraformaldehyde	Merck	30525-89-4
Pertussis toxin	e.g. List biological laboratories, Inc.	180	Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)	Sigma-Aldrich	81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche)	Sigma-Aldrich	4693132001	Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen	e.g. DAKO	S2002
sealing film e.g. Parafilm M	e.g Sigma-Aldrich	P7793
Silica gel	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	9351.1
Stitch scissor	F.S.T	15012-12
syringe 1 ml	e.g. PRIMO	62.1002
syringe 10 ml	e.g. CODAN Medical ApS	2022-05
vaporizer system Univentor 400	UNO.BV