Induction et caractérisation de l’hypertension pulmonaire chez les souris à l’aide du modèle Hypoxie/SU5416

Summary

Ce protocole décrit l’induction de l’hypertension pulmonaire (PH) chez les souris basée sur l’exposition à l’hypoxie et l’injection d’un antagoniste des récepteurs VEGF. Les animaux développent l’hypertrophie ph et ventriculaire droite (RV) 3 semaines après le début du protocole. La caractérisation fonctionnelle et morphométrique du modèle est également présentée.

Abstract

L’hypertension pulmonaire (PH) est une condition pathophysiologique, définie par une pression artérielle pulmonaire moyenne dépassant 25 mm Hg au repos, telle qu’évaluée par cathétérisme cardiaque droit. Un large éventail de maladies peut mener à PH, différent dans leur étiologie, histopathologie, présentation clinique, pronostic, et réponse au traitement. Malgré des progrès significatifs au cours des dernières années, ph reste une maladie non réparée. Comprendre les mécanismes sous-jacents peut ouvrir la voie au développement de nouvelles thérapies. Les modèles animaux sont d’importants outils de recherche pour atteindre cet objectif. Actuellement, il existe plusieurs modèles disponibles pour la récapitulation ph. Ce protocole décrit un modèle PH de souris à deux succès. Les stimuli pour le développement de PH sont l’hypoxie et l’injection de SU5416, un antagoniste du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF). Trois semaines après l’initiation de l’Hypoxie/SU5416, les animaux développent le remodelage vasculaire pulmonaire imitant les changements histopathologiques observés dans le PH humain (principalement groupe 1). Le remodelage vasculaire dans la circulation pulmonaire a comme résultat le remodelage du ventricule droit (RV). Les procédures de mesure des pressions de RV (utilisant la méthode de coffre ouvert), les analyses morphométriques du RV (par disséquer et pesant les deux ventricules cardiaques) et les évaluations histologiques du remodelage (à la fois pulmonaire en évaluant le remodelage vasculaire et cardiaque en évaluant l’hypertrophie cardiomyocyte de RV) sont décrites en détail. Les avantages de ce protocole sont la possibilité de l’application à la fois chez les souris sauvages et chez les souris génétiquement modifiées, la mise en œuvre relativement facile et peu coûteuse, et le développement rapide de la maladie d’intérêt (3 semaines). Les limites de cette méthode sont que les souris ne développent pas un phénotype grave et PH est réversible au retour à la normoxie. La prévention, ainsi que les études thérapeutiques, peuvent facilement être mises en œuvre dans ce modèle, sans la nécessité de compétences avancées (par opposition aux modèles chirurgicaux de rongeurs).

Introduction

L’hypertension pulmonaire (PH) est une affection pathophysiologique, définie par une pression artérielle pulmonaire moyenne (PA) supérieure à 25 mm Hg au repos, telle qu’évaluée par cathétérisme cardiaque droit^1,2. Il ya une variété de maladies qui peuvent conduire à PH. Dans le but d’organiser les conditions associées au PH, plusieurs systèmes de classification ont été mis au point. La classification clinique actuelle classe les multiples maladies associées au PH dans 5 groupes différents¹. Cette distinction est importante puisque divers groupes de patients ont des maladies qui diffèrent dans leur présentation clinique, la pathologie, le pronostic, et la réponse au traitement². Le tableau 1 résume la classification actuelle, complétée par les caractéristiques histopathologiques de base de chaque maladie.

Tableau 1 : Vue d’ensemble de la classification clinique de ph, ainsi que des principales caractéristiques histopathologiques au sein des groupes. Aptitude du protocole Hypoxia/SU5416 pour la modélisation de PH. Ce tableau a été modifié à partir de¹⁹. PH: Hypertension pulmonaire, HAP: Hypertension artérielle pulmonaire

Malgré des progrès significatifs dans le traitement des maladies associées au PH, PH reste toujours sans remède, avec un taux de mortalité à 3 ans allant de 20% à 80%³. Cela indique la nécessité impérative de comprendre les mécanismes sous-jacents de PH et, par la suite, le développement de nouvelles thérapies pour prévenir, ralentir la progression, et guérir la maladie. Les modèles animaux sont d’une importance cruciale pour cette portée. Actuellement, divers modèles existent pour étudier le PH. Le lecteur intéressé est référé aux excellents commentaires sur ce sujet^2,3,4. Compte tenu de la variété des maladies conduisant à la PH, il est évident que les diverses conditions de PH humaine ne peut pas être parfaitement récapitulée dans un modèle animal. Les modèles animaux disponibles peuvent être classés dans i) single-hit, ii) deux coups, iii) knock-out, et iv) modèles de surexpression³. Dans les modèles à impact unique, PH est induite par un stimulus pathologique unique, tandis que les modèles à deux coups combinent deux stimuli pathologiques dans le but d’induire un PH plus grave et donc plus étroitement imiter la maladie humaine complexe. Outre les différences étiologiques, les plusieurs stimuli entraînent des différences de modélisation ph qui dépendent aussi de l’espèce et de l’arrière-plan génétique des animaux⁴.

L’un des modèles classiques les plus couramment utilisés de rongeurs PH est le modèle chronique d’hypoxie^2. L’hypoxie est connue pour induire la PH chez l’homme ainsi que chez plusieurs espèces animales. L’hypoxie a l’avantage d’être un stimulus physiologique pour ph (Tableau 1). Cependant, alors que le degré d’hypoxie utilisé pour induire la PH chez les rongeurs est beaucoup plus grave que chez l’homme, l’insulte unique (hypoxie) conduit seulement à une forme légère de remodelage vasculaire. Cela n’imite pas la gravité de la maladie humaine. L’ajout d’un deuxième coup, un stimulus supplémentaire pour induire PH, a montré des résultats prometteurs: injection du composé SU5416 aux rongeurs combiné avec le stimulus hypoxique induit un phénotype PH plus grave^2,5,6. SU5416 est un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) récepteur-2. Il bloque les récepteurs vegf et conduit à l’apoptose des cellules endothéliales. Dans des conditions hypoxiques, cela stimule la prolifération d’un sous-ensemble de cellules endothéliales résistantes à l’apoptose. En outre, SU5416 conduit à la prolifération des cellules musculaires lisses. La combinaison de ces effets entraîne un remodelage vasculaire pathologique de la circulation pulmonaire et conduit à une pression élevée pa et le remodelage ventriculaire droit^2,5,7. Le modèle a d’abord été décrit chez les rats⁶ et plus tard appliqué sur les souris^4,5,7. Le modèle de souris présente un remodelage vasculaire moins sévère que celui des rats. En outre, lorsqu’il est retourné à la normoxie, PH continue de progresser chez les rats, tandis que chez les souris, il est partiellement réversible.

Le protocole suivant décrit toutes les étapes de modélisation de PH chez les souris à l’aide de la méthode Hypoxia/SU5416 (planification, chronologie, exécution). En outre, la caractérisation du modèle est décrite dans ce protocole : fonctionnellement (en mesurant invasivement la pression ventriculaire droite (RV) utilisant la technique de coffre ouverte), morphométrique (par disséquer et pesant les ventricules droit et gauche), aussi bien que histologiquement (en évaluant le remodelage vasculaire pulmonaire, hypertrophie et fibrose ventriculaire droite).

Toutes les étapes et méthodes décrites dans ce protocole peuvent être facilement mises en œuvre par les enquêteurs à n’importe quel niveau d’expérience. Bien que les mesures fonctionnelles du RV en utilisant la technique de la poitrine ouverte (décrite ici) ne soit pas la méthode d’étalon-or sur le terrain, elle a l’avantage qu’elle peut être rapidement apprise et reproduite avec précision même par un expérimentateur moins expérimenté.

Protocol

Avant toute expérimentation animale obtenir l’autorisation du comité local de soins aux animaux en établissement. Les expériences actuelles ont été réalisées après approbation par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) à l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï. 1. Induction de PH Préparation Avant de commencer l’étude, planifiez soigneusement la conception expérimentale. Assurez-vous que les souris sont soumises à l’…

Representative Results

Dans ce protocole, nous décrivons en détail la création du modèle Hypoxia/SU5416 pour induire le PH chez les souris. En outre, nous détaillons toutes les étapes nécessaires pour effectuer l’évaluation vasculaire pulmonaire et cardiaque à la fin de la période d’observation. Un aperçu de la conception expérimentale de ce modèle est présenté à la figure 1A13,14. Les souris…

Discussion

Ce protocole décrit comment modéliser le PH chez la souris en combinant deux stimuli pathologiques : l’hypoxie chronique et l’injection de SU5416 (Hypoxia/SU5416)¹⁸. Dans une tentative de corréler ce modèle de souris avec la condition humaine ph, il faut inévitablement regarder la classification actuelle ph, indiqué dans le tableau 1. Ph sous presque toutes les formes est caractérisée par la vasoconstriction pulmonaire et la prolifération aberrante des cellules muscul…

Materials

Acetic acid glacial	Roth	3738.1
Acetone, Histology Grade	The Lab Depot	VT110D
ADVantage Pressure-Volume System	Transonic	ADV500
Bouin's solution	Sigma	Ht10132
Cautery System	Fine Science Tools	18000-00
Connection tubing and valves
Cotton-Tipped Applicators	Covidien	8884541300
Coverslips, 24 x50 mm	Roth	1871
Data Acquisition and Analysis	Emka	iox2
Direct Red 80	Sigma	365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Sigma Aldrich	276855
Dry ice
Dumont # 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont # 7 Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Embedding molds	Sigma Aldrich	E-6032
Eosin Solution Aqueous	Sigma	HT110216
Ethanol, laboratory Grade	Carolina Biological Supply Company	861285
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Goat Serum	invitrogen	16210-064
Heating pad	Gaymar	T/Pump
Hematoxylin 2	Thermo Scientific	7231
Hypoxic chamber	Biospherix	A30274P
Induction chamber	DRE Veterinary	12570
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") )	Terumo	SR*FF2025
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-40
Isoflurane vaporizer	DRE Veterinary	12432
Mice (C57BL/6)	Charles River
Needles 25 G x 5/8"	BD	305122
OCT	Tissue Tek	4583
PBS (Phosphate Buffered Saline)	Corning	21-031-CV
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 %	Sigma	P6744-1GA
Pressure volume catheter	Transonic	FTH-1212B-4018
Retractor	Kent Scientific	SURGI-5001
Static oxygen Controller ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
Surgical tape	3M	1527-1
Syringe 10 ml	BD	303134
Syringes with needle 1 ml	BD	309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain	Thermo Scientific	S7020
Tenotomy scissors	Pricon	60-521
Toluol	Roth	9558.3
Ventilator	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
Xylene	Roth