Induksjon og karakterisering av pulmonal hypertensjon hos mus ved bruk av hypoksi/SU5416-modellen

Summary

Denne protokollen beskriver induksjon av pulmonal hypertensjon (PH) hos mus basert på eksponering for hypoksi og injeksjon av en VEGF reseptor antagonist. Dyrene utvikler PH og høyre ventrikulær (RV) hypertrofi 3 uker etter initiering av protokollen. Den funksjonelle og morfometriekarakteriseringen av modellen presenteres også.

Abstract

Pulmonal hypertensjon (PH) er en patofysiologisk tilstand, definert av et gjennomsnittlig pulmonal arterielt trykk som overstiger 25 mm Hg i ro, som vurdert ved høyre hjertekateterisering. Et bredt spekter av sykdommer kan føre til PH, forskjellig i deres etiologi, histopatologi, klinisk presentasjon, prognose og respons på behandling. Til tross for betydelig fremgang de siste årene, er PH fortsatt en uregistrert sykdom. Å forstå de underliggende mekanismene kan bane vei for utvikling av nye terapier. Dyremodeller er viktige forskningsverktøy for å oppnå dette målet. For tiden er det flere modeller tilgjengelig for rekapituerende PH. Denne protokollen beskriver en to-hit mus PH-modell. Stimuli for PH utvikling er hypoksi og injeksjon av SU5416, en vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) reseptor antagonist. Tre uker etter initiering av hypoksi/SU5416 utvikler dyr lungevaskulær remodeling som etterligner histopatologiske endringer observert i human PH (hovedsakelig gruppe 1). Vaskulær remodeling i lungesirkulasjonen resulterer i ombygging av høyre ventrikkel (RV). Prosedyrene for måling av bobiltrykk (ved hjelp av den åpne brystmetoden), de morfologiske analysene av bobilen (ved å dissekere og veie både hjerte ventrikler) og histologiske vurderinger av remodeling (både lunge ved å vurdere vaskulær remodeling og hjerte ved å vurdere RV kardiomyocytt hypertrofi og fibrose) er beskrevet i detalj. Fordelene med denne protokollen er muligheten for søknaden både i vill type og i genmodifiserte mus, den relativt enkle og rimelige implementeringen, og den raske utviklingen av sykdommen av interesse (3 uker). Begrensninger av denne metoden er at mus ikke utvikler en alvorlig fenotype og PH er reversibel når de går tilbake til normoksi. Forebygging, samt terapistudier, kan enkelt implementeres i denne modellen, uten nødvendigheten av avanserte ferdigheter (i motsetning til kirurgiske gnagermodeller).

Introduction

Pulmonal hypertensjon (PH) er en patofysiologisk tilstand, definert av et gjennomsnittlig lungearterialt (PA) trykk som overstiger 25 mm Hg i ro, som vurdert ved høyre hjertekateterisering^1,2. Det finnes en rekke sykdommer som kan føre til PH. I et forsøk på å organisere ph-tilknyttede forhold er det utviklet flere klassifiseringssystemer. Den nåværende kliniske klassifiseringen kategoriserer flere PH-assosierte sykdommer i 5 forskjellige^{grupper 1}. Dette skillet er av betydning siden ulike pasientgrupper har sykdommer som varierer i klinisk presentasjon, patologi, prognose og respons på behandling². Tabell 1 oppsummerer den nåværende klassifiseringen, supplert med de grunnleggende histopatologiske egenskapene til hver sykdom.

Tabell 1: Oversikt over klinisk klassifisering av PH, sammen med de viktigste histopatologiske trekkene i gruppene. Egnetheten til Hypoksi/SU5416-protokollen for modellering av PH. Denne tabellen er endret fra¹⁹. PH: Pulmonal hypertensjon, PAH: Pulmonal arteriell hypertensjon

Til tross for betydelige fremskritt i behandlingen av PH-assosierte sykdommer, forblir PH fortsatt uten en kur, med en 3-års dødelighet mellom 20% og 80%³. Dette indikerer det avgjørende behovet for å forstå de underliggende mekanismene til PH og deretter utviklingen av nye terapier for å forhindre, bremse utviklingen og kurere sykdommen. Dyremodeller er av avgjørende betydning for dette omfanget. For tiden finnes det ulike modeller for å studere PH. Den interesserte leseren er referert til de gode anmeldelsene om dette emnet^2,3,4. Med tanke på mangfoldet av sykdommer som fører til PH, er det åpenbart at de ulike forholdene til menneskelig PH ikke kan perfekt rekakalateres i en dyremodell. Dyr modeller tilgjengelig kan kategoriseres i i) single-hit, ii) to-hit, iii) knockout, og iv) overexpression modeller³. I single-hit-modellene induseres PH av en enkelt patologisk stimulans, mens to-hit-modeller kombinerer to patologiske stimuli med mål om å indusere mer alvorlig PH og dermed nærmere etterligne den komplekse menneskelige sykdommen. Foruten de etiologiske forskjellene resulterer de flere stimuliene i PH-modelleringsforskjeller som også avhenger av arten og dyrenes genetiske bakgrunn⁴.

En av de mest brukte klassiske PH gnagermodeller er kronisk hypoksi modell². Hypoksi er kjent for å indusere PH hos mennesker så vel som i flere dyrearter. Hypoksi har fordelen av å være en fysiologisk stimulans for PH (tabell 1). Men mens graden av hypoksi som brukes til å indusere PH hos gnagere er mye mer alvorlig enn hos mennesker, fører enkeltfornærmelse (hypoksi) bare til en mild form for vaskulær ombygging. Dette imiterer ikke alvorlighetsgraden av den menneskelige sykdommen. Tilsetning av en andre-hit, en ekstra stimulans for å indusere PH, viste lovende resultater: injeksjon av forbindelsen SU5416 til gnagere kombinert med hypoksisk stimulans^indusereren mer alvorlig PH fenotype 2^,5,6. SU5416 er en hemmer av vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) reseptor-2. Det blokkerer VEGF reseptorer og fører til endotelcelle apoptose. Under hypoksiske forhold stimulerer dette spredningen av en undergruppe av apoptoseresistente endotelceller. Videre fører SU5416 til jevn muskelcellespredning. Kombinasjonen av disse effektene resulterer i patologisk vaskulær remodeling av lungesirkulasjonen og fører til forhøyet PA-trykk og høyre ventrikulær remodeling^2,,5,,7. Modellen ble først beskrevet hos rotter^{6 og} senere brukt på mus^4,5,7. Musemodellen viser mindre alvorlig vaskulær ombygging sammenlignet med rotter. Videre, når den returneres til normoksi, fortsetter PH å utvikle seg hos rotter, mens hos mus er det delvis reversibel.

Følgende protokoll beskriver alle trinnene for modellering av PH hos mus ved hjelp av Hypoksi/SU5416-metoden (planlegging, tidslinje, utførelse). I tillegg er karakteriseringen av modellen beskrevet i denne protokollen: funksjonelt (ved å måle riktig ventrikulært (RV) trykk ved hjelp av den åpne brystteknikken), morfometrisk (ved å dissekere og veie både høyre og venstre ventrikler), samt histologisk (ved å evaluere lungevaskulær remodeling, høyre ventrikulær kardiomyocytt hypertrofi og fibrose).

Alle trinnene og metodene som er beskrevet i denne protokollen, kan enkelt implementeres av undersøkere på alle erfaringstrinn. Mens de funksjonelle målingene av RV ved hjelp av den åpne brystteknikken (beskrevet her) ikke er gullstandardmetoden i feltet, har den fordelen at den raskt kan læres og nøyaktig reproduseres selv av en mindre erfaren eksperimenterer.

Protocol

Før noen dyreforsøk få den lokale institusjonelle dyrevernkomiteen autorisasjon. De nåværende eksperimentene ble utført etter godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai. 1. PH induksjon Forberedelse Før du begynner studien, nøye planlegge eksperimentell design. Sørg for at mus utsettes for hypoksi samtidig som den første SU5416 injeksjonen. Et eksempel på eksperimentell design for å indusere PH v…

Representative Results

I denne protokollen beskriver vi i detalj opprettelsen av Hypoksi/SU5416-modellen for å indusere PH hos mus. Videre beskriver vi alle nødvendige tiltak for å utføre lungevaskulær og hjerteevaluering på slutten av observasjonsperioden. En oversikt over eksperimentell design for denne modellen er vist i figur 1A13,14. Mus utsettes for normobar hypoksi (10 % O2) og injiseres …

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan man modellerer PH hos mus ved å kombinere to patologiske stimuli: kronisk hypoksi og SU5416 injeksjon (Hypoksi/SU5416)¹⁸. I et forsøk på å korrelere denne musemodellen med den menneskelige PH-tilstanden, må man uunngåelig se på den nåværende PH-klassifiseringen, vist i tabell 1. PH i nesten alle former er preget av lungevasokonstriksjon og avvikende spredning av endotel- og glatte muskelceller. Dette fører til forhøyet trykk i lungear…

Materials

Acetic acid glacial	Roth	3738.1
Acetone, Histology Grade	The Lab Depot	VT110D
ADVantage Pressure-Volume System	Transonic	ADV500
Bouin's solution	Sigma	Ht10132
Cautery System	Fine Science Tools	18000-00
Connection tubing and valves
Cotton-Tipped Applicators	Covidien	8884541300
Coverslips, 24 x50 mm	Roth	1871
Data Acquisition and Analysis	Emka	iox2
Direct Red 80	Sigma	365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Sigma Aldrich	276855
Dry ice
Dumont # 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont # 7 Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Embedding molds	Sigma Aldrich	E-6032
Eosin Solution Aqueous	Sigma	HT110216
Ethanol, laboratory Grade	Carolina Biological Supply Company	861285
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Goat Serum	invitrogen	16210-064
Heating pad	Gaymar	T/Pump
Hematoxylin 2	Thermo Scientific	7231
Hypoxic chamber	Biospherix	A30274P
Induction chamber	DRE Veterinary	12570
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") )	Terumo	SR*FF2025
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-40
Isoflurane vaporizer	DRE Veterinary	12432
Mice (C57BL/6)	Charles River
Needles 25 G x 5/8"	BD	305122
OCT	Tissue Tek	4583
PBS (Phosphate Buffered Saline)	Corning	21-031-CV
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 %	Sigma	P6744-1GA
Pressure volume catheter	Transonic	FTH-1212B-4018
Retractor	Kent Scientific	SURGI-5001
Static oxygen Controller ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
Surgical tape	3M	1527-1
Syringe 10 ml	BD	303134
Syringes with needle 1 ml	BD	309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain	Thermo Scientific	S7020
Tenotomy scissors	Pricon	60-521
Toluol	Roth	9558.3
Ventilator	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
Xylene	Roth