Indução e Caracterização da Hipertensão Pulmonar em Camundongos usando o Modelo De Hypoxia/SU5416

Summary

Este protocolo descreve a indução da hipertensão pulmonar (PH) em camundongos com base na exposição à hipóxia e na injeção de um antagonista receptor VEGF. Os animais desenvolvem hipertrofia ph e ventricular direita (RV) 3 semanas após o início do protocolo. A caracterização funcional e morfométrica do modelo também é apresentada.

Abstract

Hipertensão Pulmonar (AP) é uma condição fisioterológica, definida por uma pressão arterial pulmonar média superior a 25 mm Hg em repouso, conforme avaliado pelo cateterismo cardíaco direito. Um amplo espectro de doenças pode levar à ETI, diferindo em sua etiologia, histopatologia, apresentação clínica, prognóstico e resposta ao tratamento. Apesar dos progressos significativos nos últimos anos, a AP continua sendo uma doença não recorrente. Compreender os mecanismos subjacentes pode abrir caminho para o desenvolvimento de novas terapias. Modelos animais são importantes ferramentas de pesquisa para alcançar esse objetivo. Atualmente, existem vários modelos disponíveis para recapitulação de PH. Este protocolo descreve um modelo PH de dois hits do mouse. Os estímulos para o desenvolvimento de PH são a hipóxia e a injeção de SU5416, um antagonista do receptor fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Três semanas após o início da Hipóxia/SU5416, os animais desenvolvem remodelação vascular pulmonar imitando as alterações histopatológicas observadas na AP humana (predominantemente grupo 1). A remodelação vascular na circulação pulmonar resulta na remodelação do ventrículo direito (RV). Os procedimentos para medir as pressões de RV (utilizando o método do peito aberto), as análises morfômicas do RV (dissecando e pesando ambos os ventrículos cardíacos) e as avaliações histológicas da remodelagem (tanto pulmonares através da avaliação da remodelagem vascular quanto do cardíaco, avaliando a hipertrofia e a fibrose cardiomiocócica do RV) são descritas detalhadamente. As vantagens deste protocolo são a possibilidade da aplicação tanto em camundongos selvagens quanto em camundongos geneticamente modificados, a implementação relativamente fácil e de baixo custo, e o rápido desenvolvimento da doença de interesse (3 semanas). As limitações deste método são que os camundongos não desenvolvem um fenótipo grave e a FP é reversível no retorno à normoxia. A prevenção, assim como os estudos terapêuticos, podem ser facilmente implementados neste modelo, sem a necessidade de habilidades avançadas (em oposição aos modelos de roedores cirúrgicos).

Introduction

Hipertensão pulmonar (AP) é uma condição fisioterológica, definida por uma pressão arterial pulmonar média (PA) superior a 25 mm Hg em repouso, conforme avaliado pelo cateterismo cardíaco direito^1,,2. Há uma variedade de doenças que podem levar à PH. Na tentativa de organizar as condições associadas ao PH, vários sistemas de classificação foram desenvolvidos. A classificação clínica atual categoriza as múltiplas doenças associadas à AP em 5 diferentes grupos¹. Essa distinção é importante, pois vários grupos de pacientes possuem doenças que diferem em sua apresentação clínica, patologia, prognóstico e resposta ao tratamento². A Tabela 1 resume a classificação atual, complementada com as características histopatológicas básicas de cada doença.

Tabela 1: Visão geral da classificação clínica de PH, juntamente com as principais características histopatológicas dentro dos grupos. Adequação do protocolo Hypoxia/SU5416 para modelagem de PH. Esta tabela foi modificada a partir de¹⁹. PH: Hipertensão pulmonar, PAH: Hipertensão Arterial Pulmonar

Apesar dos avanços significativos no tratamento de doenças associadas à AP, a AP ainda permanece sem cura, com uma taxa de mortalidade de 3 anos variando entre 20% e 80%³. Isso indica a necessidade imperativa de compreender os mecanismos subjacentes da AP e, posteriormente, o desenvolvimento de novas terapias para prevenir, retardar a progressão e curar a doença. Modelos animais são de importância crucial para este escopo. Atualmente, existem vários modelos para estudar PH. O leitor interessado é encaminhado para as excelentes avaliações sobre este tópico^2,3,4. Tendo em vista a variedade de doenças que levam à PH, é óbvio que as diversas condições da AP humana não podem ser perfeitamente recapituladas em um modelo animal. Os modelos animais disponíveis podem ser categorizados em i) single-hit, ii) two-hit, iii) knockout, e iv) overexpression models³. Nos modelos de um único hit, a FP é induzida por um único estímulo patológico, enquanto os modelos de dois hits combinam dois estímulos patológicos com o objetivo de induzir a PH mais grave e, assim, imitar mais de perto a complexa doença humana. Além das diferenças etiológicas, os diversos estímulos resultam em diferenças de modelagem de PH que dependem também da espécie e do fundo genético dos animais⁴.

Um dos modelos clássicos de roedores PH mais usados é o modelo de hipóxia crônica². A hipóxia é conhecida por induzir PH em humanos, bem como em várias espécies animais. A hipóxia tem a vantagem de ser um estímulo fisiológico para PH (Tabela 1). No entanto, enquanto o grau de hipóxia usado para induzir PH em roedores é muito mais grave do que em humanos, o único insulto (hipóxia) leva apenas a uma forma leve de remodelagem vascular. Isso não imita a gravidade da doença humana. A adição de um segundo hit, um estímulo extra para induzir a PH, mostrou resultados promissores: a injeção do composto SU5416 aos roedores combinado com o estímulo hipóxico induz um fenótipo PH mais grave^2,,5,6. SU5416 é um inibidor do receptor fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) receptor-2. Bloqueia os receptores VEGF e leva à apoptose celular endotelial. Em condições hipóxiis, isso estimula a proliferação de um subconjunto de células endoteliais resistentes à apoptose. Além disso, o SU5416 leva à proliferação de células musculares lisas. A combinação desses efeitos resulta em remodelação vascular patológica da circulação pulmonar e leva à elevada pressão da AF e remodelação ventricular direita^2,,5,,7. O modelo foi descrito pela primeira vez em ratos⁶ e posteriormente aplicado em camundongos^4,5,7. O modelo do mouse exibe remodelagem vascular menos severa em comparação com ratos. Além disso, quando retornado à normoxia, a AP continua a progredir em ratos, enquanto em camundongos é parcialmente reversível.

O protocolo a seguir descreve todas as etapas para modelagem de PH em camundongos usando o método Hypoxia/SU5416 (planejamento, cronograma, execução). Além disso, a caracterização do modelo está descrita neste protocolo: funcionalmente (medindo invasivamente a pressão ventricular direita (RV) utilizando a técnica do peito aberto), morfometricamente (dissecando e pesando tanto os ventrículos direito quanto esquerdo), bem como histologicamente (avaliando a remodelagem vascular pulmonar, hipertrofia cardiomiófica ventricular direita e fibrose).

Todas as etapas e métodos descritos neste protocolo podem ser facilmente implementados pelos investigadores em qualquer nível de experiência. Embora as medidas funcionais do RV usando a técnica de peito aberto (descrita aqui) não seja o método padrão-ouro no campo, ele tem a vantagem de que pode ser rapidamente aprendido e reproduzido com precisão até mesmo por um experimentador menos experiente.

Protocol

Antes de qualquer experimentação animal obter a autorização do comitê de cuidados com animais institucionais locais. Os experimentos atuais foram realizados após aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai. 1. Indução de PH Preparação Antes de iniciar o estudo, planeje cuidadosamente o projeto experimental. Certifique-se de que os camundongos são submetidos à hipóxia ao mesmo tempo que a pri…

Representative Results

Neste protocolo, descrevemos detalhadamente a criação do modelo Desoxia/SU5416 para induzir a PH em camundongos. Além disso, detalhamos todas as etapas necessárias para a realização da avaliação vascular e cardíaca pulmonar no final do período de observação. Uma visão geral do design experimental para este modelo é mostrada na Figura 1A13,14. Os camundongos são submetidos à…

Discussion

Este protocolo descreve como modelar PH em camundongos combinando dois estímulos patológicos: hipoxia crônica e injeção de SU5416 (Hipóxia/SU5416)¹⁸. Na tentativa de correlacionar este modelo de mouse com a condição ph humana, inevitavelmente deve-se olhar para a classificação PH atual, mostrada na Tabela 1. A PH em quase todas as formas é caracterizada pela vasoconstrição pulmonar e proliferação aberrante de células musculares endoteliais e lisas. Isso leva a uma …

Materials

Acetic acid glacial	Roth	3738.1
Acetone, Histology Grade	The Lab Depot	VT110D
ADVantage Pressure-Volume System	Transonic	ADV500
Bouin's solution	Sigma	Ht10132
Cautery System	Fine Science Tools	18000-00
Connection tubing and valves
Cotton-Tipped Applicators	Covidien	8884541300
Coverslips, 24 x50 mm	Roth	1871
Data Acquisition and Analysis	Emka	iox2
Direct Red 80	Sigma	365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Sigma Aldrich	276855
Dry ice
Dumont # 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont # 7 Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Embedding molds	Sigma Aldrich	E-6032
Eosin Solution Aqueous	Sigma	HT110216
Ethanol, laboratory Grade	Carolina Biological Supply Company	861285
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Goat Serum	invitrogen	16210-064
Heating pad	Gaymar	T/Pump
Hematoxylin 2	Thermo Scientific	7231
Hypoxic chamber	Biospherix	A30274P
Induction chamber	DRE Veterinary	12570
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") )	Terumo	SR*FF2025
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-40
Isoflurane vaporizer	DRE Veterinary	12432
Mice (C57BL/6)	Charles River
Needles 25 G x 5/8"	BD	305122
OCT	Tissue Tek	4583
PBS (Phosphate Buffered Saline)	Corning	21-031-CV
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 %	Sigma	P6744-1GA
Pressure volume catheter	Transonic	FTH-1212B-4018
Retractor	Kent Scientific	SURGI-5001
Static oxygen Controller ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
Surgical tape	3M	1527-1
Syringe 10 ml	BD	303134
Syringes with needle 1 ml	BD	309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain	Thermo Scientific	S7020
Tenotomy scissors	Pricon	60-521
Toluol	Roth	9558.3
Ventilator	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
Xylene	Roth