Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Summary

Viene descritta una procedura passo-passo per l’immobilizzazione senza etichette di esosomi e vescicoli extracellulari da campioni liquidi e la loro imaging mediante microscopia a forza atomica (AFM). Le immagini AFM vengono utilizzate per stimare le dimensioni delle vesciche nella soluzione e caratterizzare altre proprietà biofisiche.

Abstract

Gli esosomi e altre vesciche extracellulari (EV) sono complessi molecolari costituiti da una vescica della membrana lipidica, la sua decorazione superficiale da proteine della membrana e altre molecole, e diversi contenuti luminali ereditati da una cellula madre, che include RNA, proteine e DNA. La caratterizzazione delle dimensioni idrodinamiche dei VE, che dipende dalle dimensioni della vescica e dal suo strato coronale formato da decorazioni superficiali, è diventata di routine. Per gli esosomi, il più piccolo dei VE, la differenza relativa tra le dimensioni idrodinamiche e vescicle è significativa. La caratterizzazione delle dimensioni delle vesciche mediante l’imaging criogenico elettronico (crio-TEM), una tecnica gold standard, rimane una sfida a causa del costo dello strumento, delle competenze necessarie per eseguire la preparazione del campione, l’imaging e analisi dei dati, e un piccolo numero di particelle spesso osservate nelle immagini. Un’alternativa ampiamente disponibile e accessibile è la microscopia a forza atomica (AFM), in grado di produrre dati versatili sulla geometria tridimensionale, le dimensioni e altre proprietà biofisiche delle vesciche extracellulari. Il protocollo sviluppato guida gli utenti nell’utilizzare questo strumento analitico e delinea il flusso di lavoro per l’analisi dei veicoli elettrici da parte dell’AFM, che include la preparazione del campione per l’imaging dei vee EV in forma idratata o desiccata, l’immobilizzazione elettrostatica su un substrato, l’acquisizione dei dati, la sua analisi e interpretazione. I risultati rappresentativi dimostrano che la fissazione dei verisulla superficie mica modificata è prevedibile, personalizzabile e consente all’utente di ottenere risultati di dimensionamento per un gran numero di vesciche. Il dimensionamento della vescica basato sui dati AFM è risultato coerente con l’imaging crio-TEM.

Introduction

Le vesciche extracellulari (EV) sono presenti in tutti i fluidi corporei, tra cui sangue, urina, saliva, latte e liquido amniotico. Gli esosomiti formano una classe distrettuale di veicoli elettrici differenziati dagli altri VE dalla biogenesi endosomica, dai marcatori del percorso endosomico e dalla dimensione più piccola tra tutti i veicoli elettrici. La dimensione degli esosomi è spesso riportata con una sostanziale variabilità tra gli studi. I risultati del dimensionamento sono risultati dipendenti dal metodo, riflettendo la differenza nei principi fisici impiegati da diverse tecniche analitiche per stimare le dimensioni EV^1,2. Ad esempio, l’analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA), la tecnica di caratterizzazione delle dimensioni più utilizzata, stima la dimensione degli EV come diametri idrodinamici, che caratterizzano la resistenza alla mobilità browniana dei veicoli elettrici nella soluzione. Un diametro idrodinamico maggiore di una vescica implica la sua minore mobilità in liquido. Lo strato coronale intorno alle vesciche, costituito da proteine superficiali e altre molecole ancorate o adsorbite alla superficie della membrana, ostacola sostanzialmente la mobilità e aumenta le dimensioni idrodinamiche degli EV. In termini relativi, questo aumento è particolarmente elevato per gli esosomi³, come illustrato nella Figura 1.

La microscopia criogenica degli elettroni a trasmissione (crio-TEM) è una tecnica definitiva nella caratterizzazione delle dimensioni delle vescicole e della morfologia nei loro stati idratati. Tuttavia, l’elevato costo della strumentazione e le competenze specialistiche necessarie per utilizzarla motivano correttamente l’esplorazione di tecniche alternative in grado di identificare i veicoli elettrici idratati. Un numero relativamente ridotto di veicoli elettrici osservati o caratterizzati nelle immagini crio-TEM acquisite è un altro notevole svantaggio di questa tecnica.

La microscopia a forza atomica (AFM) visualizza la topografia tridimensionale degli EV idratati o desiccati^4,5,6 mediante la scansione di una sonda sul substrato per raster l’immagine delle particelle sulla superficie. Le fasi essenziali del protocollo per caratterizzare i veicoli elettrici da aFM sono descritte in questo studio. Prima di imaging delle vesciche in liquido, devono essere immobilizzate su un substrato legandosi a una superficie funzionalizzata, intrappolando in un filtro o per attrazione elettrostatica⁷. La fissazione elettrostatica su un substrato caricato positivamente è un’opzione particolarmente conveniente per l’immobilizzazione degli esosomi noti per avere un potenziale zeta negativo. Tuttavia, anche le stesse forze elettrostatiche che immobilizzano le vesciche extracellulari sulla superficie distorcono la loro forma, il che rende essenziale l’analisi dei dati post-imaging. Elaboriamo questo punto descrivendo l’algoritmo che stima la dimensione delle vescicoli globulari nella soluzione sulla base dei dati AFM sulla forma distorta degli esosomi immobilizzati sulla superficie.

Nel protocollo sviluppato, viene presentata la procedura per la robusta immobilizzazione elettrostatica delle vescicole e seguita dai passaggi necessari per eseguire l’imaging della forza atomica negli stati idratati o desiclati. Vengono identificati i fattori che influenzano la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate. La guida è fornita su come eseguire l’immobilizzazione elettrostatica per campioni con diverse concentrazioni di EV nella soluzione. Viene discussa la selezione di condizioni sperimentali che consentano la stima delle distribuzioni di probabilità empiriche di diverse proprietà biofisiche sulla base di un numero sufficientemente elevato di vesciche immobilizzate. Vengono forniti esempi di analisi post-imaging dei dati AFM. In particolare, viene descritto un algoritmo per determinare la dimensione delle vesciche nella soluzione in base alla caratterizzazione AFM degli EV immobilizzati. I risultati rappresentativi mostrano la consistenza del dimensionamento della vescica da parte dell’AFM con i risultati dell’imaging crio-TEM.

Protocol

1. Isolamento dei veicoli elettrici da un biofluido Isolare gli EV con uno dei metodi stabiliti, come l’ultracentrifugazione differenziale8, precipitazioni o cromatografia di esclusione di dimensioni9. Confermare la presenza di biomarcatori superficiali e luminali previsti e l’assenza di biomarcatori che indicano la contaminazione incrociata della preparazione. Confermare la morfologia del bistrato lipidico delle particelle isolate media…

Representative Results

La fissazione superficiale dei veicoli elettrici è un passaggio fondamentale nella sequenza di imaging. L’immobilizzazione elettrostatica della superficie degli esosomi, nota per avere un potenziale zeta negativo, si verificherà in modo robusto dopo che il substrato della mica viene modificato per avere una carica superficiale positiva. Senza il trattamento con NiCl2 per impartire cambiamenti positivi di superficie, l’immobilizzazione dei veli sul substrato è risultata inefficace. L’immagine dell’altezza in…

Discussion

L’immobilizzazione dei veicoli elettrici da un fluido biologico, la scansione superficiale e l’analisi delle immagini sono i passi essenziali del protocollo sviluppato per la caratterizzazione AFM dei veicoli elettrici in liquido. Il numero di vesciche suscettibili di imaging AFM scala con la superficie di immagine e la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate sul substrato. Dato un potenziale zeta negativo di espeeedanti¹⁸, sosteniamo la fissazione elettrostatica dei veicoli elett…

Materials

AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4