단계별 절차는 액체 견본에서 엑소좀 및 세포외 소포의 표지 자유로운 고정을 위해 기술되고 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의하여 그들의 화상 진찰. AFM 이미지는 용액에서 소포의 크기를 추정하고 다른 생물 물리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
엑소좀 및 기타 세포외 소포(EV)는 지질막 소포, 막 단백질 및 기타 분자에 의한 표면 장식, RNA를 포함하는 모세포로부터 상속된 다양한 발광 량으로 구성된 분자 복합체이며, 단백질, 및 DNA. 소포의 크기와 표면 장식에 의해 형성된 관상 층의 크기에 따라 달라지는 전기 자동차의 유체 역학적 크기의 특성화는 일상화되었습니다. 엑소좀, 전기 의 가장 작은, 유체 역학 과 소포 크기 사이의 상대적 차이는 중요하다. 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM) 이미징에 의한 소포 크기의 특성화는 금 본위제 기술인 금본위제 기술로 인해 기기 의 비용, 시료 준비, 이미징 및 이미지에서 관찰되는 소수의 입자를 분석합니다. 널리 이용가능하고 접근 가능한 대안은 3차원 기하학, 크기 및 세포외 소포의 그밖 생물물리학적 특성에 대한 다양한 데이터를 생성할 수 있는 원자력 현미경 검사법(AFM)입니다. 개발된 프로토콜은 사용자가 이 분석 도구를 활용하게 하는 데 지침이 되며, AFM에 의한 전기자동차 분석을 위한 워크플로우를 간략하게 설명하며, 여기에는 수화 또는 건조 형태로 이미징 EV를 위한 샘플 준비, 정전기 적 고정화 고정화 기판, 데이터 수집, 분석 및 해석에 대한 소포. 대표적인 결과는 수정된 운소 표면에 전기 를 고정하는 것이 예측 가능하고 사용자 정의 가능하며 사용자가 많은 수의 소포에 대한 크기 조정 결과를 얻을 수 있음을 보여줍니다. AFM 데이터에 기초한 소포 크기 조정은 저온-TEM 이미징과 일치하는 것으로 나타났다.
서론
세포밖 소포 (EV)는 혈액, 소변, 타액, 우유 및 양수를 포함하여 모든 체액에서 존재합니다. 엑소좀은 내생 생물발생, 내생 통로의 마커, 모든 EV 중 가장 작은 크기로 다른 EV와 차별화된 지역 형 EV 클래스를 형성합니다. 엑소좀의 크기는 종종 연구 사이 상당한 가변성으로 보고됩니다. 상기 크기 조정 결과는 EV 크기를 추정하기 위해 상이한 분석 기법에 의해 채택된 물리적 원리의 차이를 반영하여 EV 크기1,2를반영하는 방법에 의존하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 널리 사용되는 크기 특성 화 기법인 나노 입자 추적 분석(NTA)은 용액에서 EV의 브라운 이동성에 대한 저항성을 특징짓는 유체역학적 직경으로 EV의 크기를 추정합니다. 소포의 더 큰 유체 역학 직경은 액체에서 낮은 이동성을 의미합니다. 표면 단백질 및 멤브레인 표면에 고정되거나 흡착된 다른 분자로 구성된 소포 주위의 관상 층은 이동성을 실질적으로 방해하고 전기 EV의 유체 역학적 크기를 증가시킵니다. 상대적인 측면에서, 이러한 증가는 그림 1에도시된 바와 같이 엑소좀3에대해 특히 크다.
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프로토콜
1. 바이오 유체로부터 전기 자동차 분리
- 차등 초원심분리8,강수량 또는 크기 배제 크로마토그래피 와 같은 확립된 방법 중 하나에 의해 EV를분리한다.
- 예상 표면 및 발광 바이오마커의 존재와 제제의 교차 오염을 나타내는 바이오마커의 부재를 확인합니다. 전자 현미경검사법에 의해 단리된 입자의 지질 이중층 형태를 확인한다.
참고: 엑소좀을 분리할 때 나노입자 추적 분석(NTA) 또는 동적 광 산란으로 측정된 유체역학적 크기 분포는 예상 범위에 있어야 합니다. EV 및 엑소좀 격리의 세부 사항은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 선택된 방법은 실험적인 질문과 연구10의목표에 따라 달라집니다. 다음 단계는 시판되는 침전키트(표 오브 머티리얼)를이용하여 MCF-7 유방암 세포의 성장 배지로부터의 침전에 의해 엑소좀을 풍부하게 하는 절차의 구체적인 그림을 제공한다. - 세포 배양 확장 전에 MCF-7 유방암 세포를 액체 질소에 저장하십시오. 서브 배양에 세포를 해동.
- 무균 관행에 따라 150mm 플레이트에서 셀 도금을 수행하십시오.
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결과
전기 자동차의 표면 고정은 이미징 시퀀스에서 중요한 단계입니다. 음의 제타 전위를 가진 것으로 알려진 엑소좀의 정전기 표면 고정은 운모의 기질이 양극성 표면 전하를 갖도록 변형된 후에 강력하게 발생합니다. NiCl2를 사용하여 양성 표면 변화를 부여하지 않으면 기판 상에서 의 전추가 비효율적인 것으로 나타났습니다. 도 10A의높이 이미지는, PBS의 mL당 2.59 x 1010 소포를 포함하는 MCF-7 엑소좀 샘플 후 공기중에서 획득한 것으로, 갓 갈라진 운모의 수정되지 않은 표면에서 12시간 동안 배양되었고, DI 물로 세척한 후 표면에 담습니다. 도 10A에서 볼 수 있는 소포는, 대부분, DI 물의 불완전한 포부의 결과이며, 이는 표면에 고정되지 않은 소포를 다시 매달아 증발함에 따라 기판 상에 그(것)들을 놓습니다.
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토론
생물학적 유체, 표면 스캐닝 및 이미지 분석에서 전기 EV의 고정은 액체에서 EV의 AFM 특성화를 위한 개발된 프로토콜의 필수 단계입니다. AFM 이미징 스케일에 대한 소포의 수는 기판 상에 고정된 소포의 표면적 및 표면 농도를 갖는다. 전기 자동차및 엑소좀18의부정적인 제타 전위를 감안할 때, 우리는 액체 샘플에서 AFM 기판에 이르기까지 전기 전기 적 고정을 옹호합니다. 고정은 표면이 양전하일 때 효과적입니다. EV 고정화 에 앞서, 양성 표면 전하가 운모의 경우와 같이 기판에 부여되어야 할 수도 있다―일반적인 식 KAl 2(AlSi3O10)(OH)2를가진 층화된 규산염 미네랄. 갓 갈라진 운우의 표면은 완벽하게 평평한 표면에 가깝기 때문에 AFM에 의해 나노 입자를 이미징하는 데 이상적이지만 표면 전하가 음수이므로 수정해야합니다. 프로토콜은 AFM 기판에 양성 표면 변화를 부여하는 절차를 설명합니다. .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 국립 과학 재단 (수상 번호 IGERT-0903715), 유타 대학 (화학 공학 종자 보조금 및 대학원 연구 펠로우십 상), 그리고 과학의 스콜코보 연구소의 재정 지원을 인정 기술 (스콜테크 펠로우십).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AFM/STM 컨트롤러 | Bruker | 멀티모드 나노스코프 V | 이 AFM 컨트롤러는 액체와 공기 중의 생물학적 샘플의 이미징을 지원합니다. |
| AFM/STM 금속 시편 디스크(10mm) | TedPella | 16207 | 운모 디스크를 양면 테이프 또는 기타 수단으로 부착한 금속 시편 디스크. |
| AFM/STM 운모 디스크(10mm) | TedPella | 50 | 최고 품질 등급 V1 운모, 두께 0.21mm(0.0085인치). 10개 패키지로 인터리브됩니다. AFM/STM 디스크에 장착할 수 있습니다. 공중 촬영을 위한 4가지 직경의 |
| AFM 프로브 | Bruker | TESP-V2 | 태핑 모드용 고품질 에칭 실리콘 프로브, 공중 스캔을 위한 비접촉 모드로 제공됩니다. |
| Bruker | MLCT | 소프트 샘플 이미징을 위한 AFM 프로브 | 는 액체 작동에 적합합니다. Range in force constants를 통해 사용자는 접촉 모드뿐만 아니라 고하중 대 거리 분광법에서 매우 부드러운 샘플을 이미지화할 수 있습니다. |
| 양면 테이프 | 스펙트럼 | 360-77705 | 금속 시편 디스크에 운모 디스크를 고정하는 데 사용됩니다. |
| ExoQuick-TC | 시스템 Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC는 조직 배양 배지에서 엑소좀을 분리하도록 설계된 독점적인 폴리머 기반 키트입니다. |
| 액체 Bruker 이미징을 위한 유리 프로브 AFM 홀더 | MTFML-V2 | 이 유리 프로브 홀더는 MultiMode AFM을 사용하여 유체에서 스캔하도록 설계되었습니다. 홀더는 피크 포스 태핑 모드, 접촉 모드, 태핑 모드 및 포스 모듈레이션에서 사용할 수 있습니다. 프로브는 더 큰 진폭 변조를 위해 별도의 피에조 발진기에 의해 음향적으로 구동됩니다. 홀더는 두 개의 포트, 필요한 피팅 및 유체 추가 및 제거를 위한 액세서리 키트와 함께 제공됩니다. | |
| Gwyddion | 체코 계측 연구소. | 버전 2.52 | 프로브 현미경 기술을 스캔하여 얻은 데이터 필드의 시각화 및 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어. |
| 보푸라기가 없는 압지 | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 블로팅 페이 | 이 블로팅 페이퍼를 사용하여 마이카의 기판 수정 후 NiCl2를 제거하십시오. |
| 보푸라기가 없는 클린룸 와이프 | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | 이 폴리에스테르 와이프를 사용하여 표면을 청소하십시오. |
| 니켈 (II) 염화물 (NiCl2< / sub>) | Sigma-Aldrich | 339350 | 분말은 DI 물에서 10 mM NiCl2< / sub>를 만드는 데 사용됩니다 |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
참고문헌
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. ....
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재인쇄 및 허가
