Visualização do sulco Superior Ocular durante a embriogênese Danio rerio
Summary
Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o sulco superior e ocular, uma estrutura recentemente identificada, conservado evolutivamente no olho vertebrado. Usando zebrafish larvas, demonstraremos técnicas necessárias para identificar os fatores que contribuem para a formação e o fechamento do sulco superior ocular.
Abstract
Coloboma ocular congênita é uma desordem genética que normalmente é observada como uma fissura no aspecto inferior do olho resultantes de fechamento da fissura coroide incompleta. Recentemente, a identificação de indivíduos com coloboma no aspecto superior da íris, retina e lente levado à descoberta de uma estrutura nova, conhecido como a fissura superior ou superior sulco ocular (SOS), que está presente transitoriamente na dorsal aspecto da Taça óptica durante o desenvolvimento do olho de vertebrados. Embora esta estrutura é conservada em ratos, garota, peixe e Tritão, nossa compreensão atual do SOS é limitado. A fim de elucidar os fatores que contribuem para sua formação e o encerramento, é imperativo para poder observá-lo e identificar anormalidades, tais como atraso no fechamento do SOS. Aqui, nos propusemos a criar uma série padronizada de protocolos que podem ser usados para visualizar eficientemente o SOS combinando técnicas de microscopia amplamente disponível com técnicas de biologia molecular comuns como coloração imunofluorescente e mRNA superexpressão. Enquanto este conjunto de protocolos enfoca a capacidade de observar o atraso de fechamento de SOS, é adaptável às necessidades do experimentador e pode ser facilmente modificado. Em geral, esperamos criar um método acessível através do qual a nossa compreensão do SOS pode ser avançado para expandir o conhecimento atual do desenvolvimento do olho de vertebrados.
Introduction
A formação do olho de vertebrados é um processo altamente conservado em que vias de sinalização intercelulares cuidadosamente orquestradas estabelecer tipos de tecido em especificam a identidade regional1. Perturbações de início morfogênese olho resultam em defeitos profundos para a arquitetura do olho e são frequentemente cegueira2. Uma tal doença resulta do não-fechamento da fissura coroide ocular no lado ventral da Taça óptica3. Esta doença, conhecida como coloboma ocular, estima-se que ocorrem em 1 a 4-5000 nascidos vivos e % de 3-11 causa de cegueira pediátrica, manifestando-se geralmente como uma estrutura de fechadura que se projeta inferiormente do aluno no centro do olho4, 5,6. A função da fissura coroide é fornecer um ponto de entrada para início vasculatura crescendo no copo de óptica, depois que os lados da fissura irão fundir para delimitar os navios7.
Enquanto coloboma ocular é conhecida desde os tempos antigos, nós identificamos recentemente um romance subconjunto de pacientes coloboma com perda de tecido, afetando a face superior/dorsal do olho. Trabalho recente em nosso laboratório levou à descoberta de uma estrutura ocular no olho dorsal zebrafish, que nos referimos como o sulco ocular superior (SOS) ou fissura superior8. É importante observar que a estrutura tem características de um sulco e uma fissura. É semelhante a um sulco, uma camada de tecido contínua que se estende desde o nasal da retina temporal. Além disso, o fechamento da estrutura não é mediado por uma fusão dos dois opostos da membrana basal, e parece exigir um processo morfogenético, pelo qual a estrutura é preenchida por células. No entanto, semelhante a uma fissura, forma uma estrutura que separa os lados nasais e temporais do olho dorsal com a membrana basal. Para obter consistência, nos referiremos a ela como SOS neste texto.
O SOS é evolutivamente conservado em vertebrados, sendo visível durante a morfogênese de olho no peixe, pintinho, Tritão e rato8. Em contraste com a fissura coroide, que está presente desde a pós-fertilização 20-60 horas (hpf) no zebrafish, o SOS é altamente transitório, sendo facilmente visível a partir de 20-23 hpf e ausente por 26 hpf8. Pesquisas recentes em nosso laboratório encontrou que, semelhante da fissura coroide, o SOS desempenha um papel na orientação vascular durante o olho morfogênese8. Embora os fatores que controlam a formação e o encerramento do SOS ainda não são totalmente compreendidos, nossos dados destacar papéis para dorso-ventral olho padronização genes8.
Zebrafish é um organismo modelo excelente para estudar o SOS. Como um sistema de modelo, ele fornece uma série de vantagens em estudar o desenvolvimento do olho: é um modelo de vertebrados; cada geração apresenta alta fecundidade (~ 200 embriões); seu genoma foi totalmente sequenciada, que facilita a manipulação genética; e cerca de 70% dos genes humanos têm pelo menos um orthologue zebrafish, tornando-se um modelo ideal baseado em genética de doenças humanas9,10. Mais importante ainda, seu desenvolvimento ocorre externamente à mãe, e suas larvas são transparentes, o que permite a visualização do olho em desenvolvimento com relativa facilidade11.
Este conjunto de protocolos, descrevemos as técnicas através das quais o SOS podem ser visualizado em larvas de peixe-zebra. A variedade de técnicas de visualização utilizado neste relatório permitirá clara observação do SOS durante o desenvolvimento do olho normal, bem como a capacidade de detectar defeitos de fechamento do SOS. Nossos protocolos de exemplo contará com investigações de Gdf6, um BMP localizada para o dorsal olho e conhecido regulador de encerramento de SOS. Além disso, essas técnicas podem ser combinadas com manipulações experimentais para identificar fatores genéticos ou agentes farmacológicos que afetam o fechamento e a adequada formação de SOS. Além disso, nós incluímos um protocolo através do qual a imagem fluorescente de todas as membranas celulares é possível, permitindo que o experimentador observar alterações morfológicas que as células circundantes o SOS. Nosso objetivo é estabelecer um conjunto de protocolos padronizados que podem ser usados em toda a comunidade científica para oferecer novos insights sobre esta estrutura nova do olho em desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o SOS no desenvolvimento do embrião do zebrafish. Para determinar os fenótipos de atraso de fechamento, nossos protocolos centraram-se sobre a capacidade de distinguir a separação dos dois lobos discretas dos lados nasal dorsal e dorsal-temporal do olho, semelhante às técnicas usadas para visualizar o atraso de fechamento da fissura coroide fenótipos nos olhos ventral.
Estas técnicas de visualização podem ser usada…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR), ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia (NSERC), Alberta inova tecnologia futuros e mulheres e Instituto de pesquisa de saúde (WCHRI infantil).
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
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