达尼奥胚胎发生过程中的上眼硫可视化
Summary
在这里, 我们提出了一系列标准化的协议, 以观察上眼沟, 最近确定的, 进化保存的结构在脊椎动物的眼睛。利用斑马鱼幼虫, 我们展示了必要的技术, 以确定有助于形成和关闭的上眼沟的因素。
Abstract
先天性眼结肠瘤是一种遗传性疾病, 通常被观察为眼睛下部的裂隙, 其原因是不完全的脉络膜裂隙闭合。最近, 在虹膜、视网膜和晶状体的上侧识别有结肠瘤的个体, 发现了一种新的结构, 称为上裂隙或上眼沟 (SOS), 这种结构是暂时存在于背侧的在脊椎动物眼睛发育过程中的视杯方面。虽然这种结构是在小鼠、小鸡、鱼和纽特之间保存的, 但我们目前对 SOS 的理解是有限的。为了阐明有助于其形成和关闭的因素, 必须能够观察到它, 并查明异常情况, 例如在关闭 SOS 方面的延误。在这里, 我们着手创建一系列标准化的协议, 可用于通过将广泛使用的显微镜技术与免疫荧光染色和 mRNA 等常见的分子生物学技术相结合, 有效地可视化 SOS表达。虽然这一组协议侧重于观察 sos 闭包延迟的能力, 但它能适应实验者的需要, 可以很容易地修改。总的来说, 我们希望创造一种平易近人的方法, 通过这种方法, 我们可以提高对 sos 的理解, 以扩大目前对脊椎动物眼睛发育的了解。
Introduction
脊椎动物眼的形成是一个高度保守的过程, 在这个过程中, 精心编排的细胞间信号通路建立组织类型, 并指定区域身份1。早期眼睛形态发生的扰动导致眼睛结构的深刻缺陷, 并经常致盲2。其中一种疾病是由于未能关闭视神经杯3腹侧的脉络膜眼裂隙造成的。这种被称为眼结肠瘤的疾病, 估计发生在每4-5000个活产中的 1个, 并导致3-11 的儿科失明, 通常表现为一个关键孔状结构,从眼睛中心的瞳孔下突出, 5,6。脉络膜裂隙的功能是为早期血管生长到光学杯中提供一个切入点, 之后裂隙的两侧将融合在血管7中.
虽然眼结节瘤自古以来就被人们所熟知, 但我们最近发现了一个新的结肠瘤患者的组织丢失的子集, 这些患者的组织丢失影响了眼睛的上背部。最近在我们的实验室的工作已经导致发现的眼睛结构斑马鱼背眼, 我们称之为上眼沟 (SOS) 或上裂隙8。需要注意的是, 该结构既有沟的特点, 也有裂缝的特点。类似于沟, 它是一个连续的组织层, 跨越鼻腔到颞部视网膜。此外, 结构的闭合不是由两个相对基底膜的融合介导的, 它似乎需要一个形态发生过程, 通过这个过程, 结构是由细胞填充的。然而, 类似于裂缝, 它形成了一个结构, 分离鼻腔和时间两侧的背眼与基底膜。为了保持一致, 我们将在本文中将其称为 SOS。
SOS 在进化上在脊椎动物中被保守, 在鱼类、小鸡、牛顿和小鼠8的眼睛形态发生过程中可见。与斑马鱼受精后20-60小时的脉络膜裂隙不同, SOS 是高度瞬态的, 从 20-60 hpf 很容易看到, 而在 26 hpf8时不存在。我们实验室最近的研究发现, 与脉络膜裂隙类似, sos 在眼睛形态发生过程中的血管引导中起着一定的作用。尽管控制 SOS 形成和闭合的因素尚未完全了解, 但我们的数据确实突出了背腹眼模式基因8的作用。
斑马鱼是研究 SOS 的优良模型生物。作为一个模型系统, 它为研究眼睛发育提供了许多优势: 它是一个脊椎动物模型;每一代表现出较高的繁殖力 (~ 200个胚胎);它的基因组已被完全测序, 这有利于基因操纵;约70% 的人类基因至少有一种斑马鱼的同源物, 使其成为人类疾病9,10 的理想基因模型。最重要的是, 它的发育发生在母亲的外部, 它的幼虫是透明的, 这使得它可以相对容易地显示发育中的眼睛11。
在这一组协议中, 我们描述了在斑马鱼幼虫中可视化 SOS 的技术。本报告中使用的各种可视化技术将使人们能够在正常的眼睛发育过程中清楚地观察 SOS, 并能够检测 SOS 闭合缺陷。我们的示例协议将以 Gdf6 的调查为特色, BMP 本地化为背眼和已知的 SOS 闭合调节器。此外, 这些技术可以与实验操作相结合, 以确定影响适当的 SOS 形成和关闭的遗传因素或药理作用剂。此外, 我们还包括了一个协议, 通过该协议可以对所有细胞膜进行荧光成像, 使实验者能够观察 SOS 周围细胞的形态变化。我们的目标是建立一套标准化的协议, 可以在整个科学界使用, 为这种新的发展眼结构提供新的见解。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们提出了一系列标准化的方案, 以观察 sos 在发展斑马鱼胚胎。为了确定闭合延迟表型, 我们的协议侧重于区分眼睛背鼻和背时间两侧两个离散裂片的分离能力, 类似于用于显示脉络膜裂隙闭合延迟的技术腹侧眼的表型。
这些可视化技术可与各种基因操作技术结合使用, 以研究抑制某些基因表达或诱导表达的影响, 从而研究它们在 SOS 闭合中的作用。我们选择使用gdf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了加拿大卫生研究所、自然科学和工程研究理事会、艾伯塔省创新技术未来和妇女和儿童健康研究所的支持。
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
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