Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio
Summary
Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.
Abstract
Angeborene okulären Kolobom ist eine genetische Erkrankung, die in der Regel als eine Spalte in der minderwertigen Aspekt des Auges infolge unvollständiger choroid Fissur Schließung beobachtet wird. Vor kurzem genannt die Identifikation von Personen mit Kolobom in der überlegene Aspekt der Iris, Netzhaut und Linse führte zur Entdeckung einer neuen Struktur, die überlegene Fissur oder überlegene okuläre Sulcus (SOS), die vorübergehend auf die dorsale vorhanden ist Aspekt der Optik-Cup während der vertebrate Augenentwicklung. Obwohl diese Struktur über Mäuse, Küken, Fisch und Newt konserviert ist, beschränkt sich unser heutiges Verständnis des SOS. Um Faktoren aufzuklären, die zu seiner Entstehung und Schließung beitragen, ist es unerlässlich, dass man es beobachten und erkennen Anomalien, wie Verzögerung bei der Schließung der SOS. Hier wollten wir eine standardisierte Reihe Protokolle erstellen, die verwendet werden, um effizient die SOS visualisieren durch die Kombination von allgemein verfügbaren Mikroskopiertechniken mit gemeinsamen molekularbiologische Techniken wie immunofluorescent Färbung und mRNA Überexpression. Während dieser Reihe von Protokollen konzentriert sich auf die Fähigkeit, SOS Verschluss Verzögerung zu beobachten, es ist anpassbar an die Bedürfnisse der Experimentator und kann leicht geändert werden. Alles in allem hoffen wir, eine zugängliche Methode zu erstellen, durch die unser Verständnis von der SOS vorangebracht werden kann, um das aktuelle Wissen der vertebrate Augenentwicklung zu erweitern.
Introduction
Die Bildung des vertebrate Auges ist ein hoch konservierte Prozess in dem sorgfältig orchestrierten interzelluläre Signalwege Gewebetypen zu etablieren und regionale Identität1angeben. Störungen zu frühen Auge Morphogenese häufig2Blenden und tiefgreifende Mängel an die Architektur des Auges führen. Einer solchen Krankheit ergibt sich aus der Nichtbeachtung der Aderhaut okulären Riss in der ventralen Seite des Optik-Cup3schließen. Diese Störung, bekannt als okulären Kolobom wird voraussichtlich auftreten bei 1 von 4-5000 Lebendgeburten und Ursache 3-11 % der pädiatrischen Blindheit, gemeinhin als ein Schlüsselloch-artige Struktur, die inferior aus der Pupille in der Mitte des Auges4ragt manifestieren, 5,6. Die Funktion der Aderhaut Fissur soll stellen einen Einstiegspunkt für frühen Gefäßsystem Hineinwachsen in den Optik-Cup, danach werden die Seiten des Risses Sicherung um die Schiffe7umschließen.
Während okulären Kolobom seit der Antike bekannt ist, haben wir vor kurzem eine neue Untergruppe von Kolobom Patienten mit Gewebeverlust beeinflussen den Superior/dorsalen Aspekt des Auges identifiziert. Neuere Arbeiten in unserem Labor führte zur Entdeckung einer okulären Struktur im Zebrafisch dorsalen Auge, die wir als die überlegene okuläre Sulcus (SOS) oder überlegene Fissur8bezeichnen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Struktur verfügt über Eigenschaften von einem Sulcus und ein Riss. Ähnlich wie bei einem Sulcus, ist es eine ständige Gewebeschicht, die sich aus der Nasal der zeitlichen Netzhaut erstreckt. Darüber hinaus die Schließung der Struktur wird nicht durch eine Fusion der beiden gegnerischen Basalmembran vermittelt, und es scheint einen morphogenetischen Prozess zu verlangen, mit dem die Struktur von Zellen besiedelt ist. Jedoch ähnlich wie ein Riss, bildet es eine Struktur, die die nasalen und temporalen Seiten des dorsalen Auges mit der Basalmembran trennt. Aus Konsistenzgründen werden wir bezeichnen es als SOS in diesem Text.
Die SOS ist evolutionär über Wirbeltiere, wobei sichtbar, während Auge Morphogenese in Fische, Küken, Molch und Maus8erhalten. Im Gegensatz zu der Aderhaut Fissur, die von 20 bis 60 Stunden nach Befruchtung (hpf) im Zebrafisch vorhanden ist, die SOS ist sehr flüchtig, wird gut sichtbar von 20-23 hpf und abwesend von 26 hpf-8. Neuere Forschungen in unserem Labor hat festgestellt, dass ähnlich wie bei der Aderhaut Fissur, die SOS eine Rolle bei vaskulären Führung während Auge Morphogenese8 spielt. Obwohl die Faktoren, die die Gründung und Schließung der SOS noch nicht vollständig verstanden sind, unsere Daten für dorsal-Ventral Auge Musterung Gene8Rollen markieren.
Zebrafisch ist eine ausgezeichnete Modellorganismus der SOS zu studieren. Als Modellsystem, bietet es eine Reihe von Vorteilen bei der Untersuchung der Augenentwicklung: Es ist ein Wirbeltier Modell; Jede Generation weist hohe Fruchtbarkeit (~ 200 Embryonen); seines Genoms wurde vollständig sequenziert, erleichtert die Genmanipulation; und etwa 70 % der menschlichen Gene haben mindestens ein Zebrafisch orthologs, so dass es ein ideales Genetik-basierte Modell der menschlichen Krankheit9,10. Vor allem seine Entwicklung erfolgt extern an die Mutter, und seine Larven sind transparent, wodurch für die Visualisierung des dritten Auges mit relativer Leichtigkeit11.
In dieser Reihe von Protokollen beschreiben wir die Techniken, durch die die SOS im Zebrafischlarven visualisiert werden kann. Die Vielfalt der Visualisierungs-Techniken, die in diesem Bericht verwendeten ermöglicht klare Beobachtung von SOS während der normalen Augenentwicklung sowie die Fähigkeit, SOS Schließung Mängel zu erkennen. Unsere Beispiel-Protokolle werden Untersuchungen von Gdf6, einem BMP in dorsal lokalisiert Auge und bekannten Regulator der SOS-Verschluss. Darüber hinaus können diese Techniken mit experimentellen Manipulationen zu identifizieren genetische Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe, die richtige SOS-Gründung und Schließung beeinflussen kombiniert werden. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll durch die fluoreszente-Bildgebung aller Zellmembranen möglich ist, so dass des Experimentators, morphologische Veränderungen an den Zellen rund um den SOS zu beobachten aufgenommen. Unser Ziel ist es, eine Reihe von standardisierten Protokollen zu etablieren, die in der wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet werden können, bieten neue Einblicke in diese neuartige Struktur des dritten Auges.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine standardisierte Reihe von Protokollen, die SOS im sich entwickelnden Zebrafischembryo zu beobachten. Ermitteln, Schließung Verzögerung Phänotypen, konzentrierten sich unsere Protokolle auf die Fähigkeit, die Trennung von zwei diskreten Lappen der dorsalen Nasal und dorsal-zeitliche Seiten des Auges, vergleichbar mit Techniken zur Aderhaut Fissur Verschluss Verzögerung visualisieren unterscheiden in den Augen der ventralen Phänotypen.
Diese Visualisierung…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR), Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC), Alberta innoviert Technologie Futures, und Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) unterstützt.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
