갤러리아 mellonella 구강 관리 모델 Study Commensal-Induced 타고 난 면역 반응에
Summary
여기, 우리 갤러리아 mellonella 애벌레를 사용 하는 구강 관리 모델에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 특성화 하는 방법을 타고 난 면역 반응 유도. 이 프로토콜을 사용 하 여, 실제적인 경험 없이 연구원 G. mellonella 강제로 메서드를 사용할 수 있게 됩니다.
Abstract
숙주 면역 체계에 공생 박테리아의 면역성 잠재력의 조사 장 호스트-미생물 상호 작용을 공부 하면 한 필수 구성 요소입니다. 그것은 잘 다른 공생 호스트 장 면역 체계를 자극 하는 다른 잠재력을 전시 설립. 이러한 조사는 척추 동물, 특히 설치류를 포함 한다. 이후 증가 윤리적인 우려 척추 동물을 포함 하는 실험과 함께 연결, 무척 추 동물 대체 모델에 대 한 높은 수요가 있다.
여기, 우리는 G. mellonella 면역 시스템에 공생 비 병원 성 박테리아와 공생의 면역성 잠재력의 가능한 평가 사용 하 여 갤러리아 mellonella 구강 관리 모델을 제공 합니다. G. mellonella Bacteroides vulgatus , 대장균등 다른 면역성 잠재력과 공생의 분석을 허용 하는 유용한 다른 무척 추 동물 대체 모델은 설명 합니다. 흥미롭게도, 박테리아 전시는 포유류와 비슷한 애벌레에 죽이 효과가 없습니다. G. mellonella 의 면역 반응 척 추가 있는 타고 난 면역 반응에 대 등 했다 하 고 박테리아의 인식 및 항균 분자의 생산을 포함 한다. 우리가 제안 하는 G. mellonella 건강 한 포유류 개인에서 잘 알려진 이전 microbiota 균형을 복구할 수 있었다. 제공 하는 G. mellonella 및 척추 동물에 비해 타고 난 면역 반응, 비록 G. mellonella 는 적합 한 면역 계통 항구 하지 않습니다. 타고 난 면역 체계의 구성 하는 조사 요소는 진화 보존, 모델 세균 면역성 속성의 첫 번째 해 분석을 수 있습니다.
Introduction
장내 미생물의 항상성 유지를 위한 필수 구성 요소 이며 모두 타고 난 및 적응형 면역 반응1,2를 포함 한다. 공생 microbiota 커뮤니티 다른 주요 공생 성분에 의해 특징입니다: symbionts 중요 한 immunomodulatory 기능을 가질 수 있는 해로운 효과 유전으로 predisposed pathobionts 효능 효과 부여 호스트 및 홍보 하 고 방 아 쇠 창 자 염증3,4. Symbionts 및 pathobionts에 대 한 많은 연구와 숙주 면역 체계에 영향을 미치는 그들의 주로 공부 적응 면역 응답 출판 되었습니다.
이러한 연구 조사와 보호에 대 한 많은 동물 포함 동물 실험에 대 한 사용의 공공 이익 증가의 이후 우리는 찾을 수 있도록 다른 박테리아의 심사에 대 한 면역성 대체 모델 추구 속성입니다. 곤충, 특히 갤러리아 mellonella, 감염 연구에서 널리 사용 되는 대체 모델은. G. mellonella 는 낮은 비용, 높은 처리량; 등 다른 장점 결합 그것은 자연 노출 경로 박테리아의 구강 관리를 허용 하 고 조직의 감염5,6있습니다. G. mellonella 더 포유류와 세균 독성 인자 식5에 대 한 최적의 생리 적 체온은 37 ° C에 외피를 수 있습니다. G. mellonella 의 주요 장점은 보존된 타고 난 면역 시스템을 비 자체에서 자기의 차별 하 고 인코딩합니다 opsonin hemolin6, 또는 apolipophorin 같은 패턴 인식 수용 체의 다양 한 7. 미생물 인식 시 G. mellonella 다른 다운스트림 체액 면역 응답을 실행할 수 있습니다. 그것은 산화 긴장 응답을 유도 하 고 개 (질소 산화 효소 synthase)와 NOX (NADPH 산화 효소)6,8의 활동을 포함 하는 반응성 산소 종 (선생님)을 분 비 수 있습니다. G. mellonella gloverin, moricin, cecropin 또는 defensin 같은 gallerimycin6, 등의 다른 혼합물의 분 비에 결과 강력한 항균 성 펩 티 드 (AMP) 응답을 활성화 하는 또한, 8,,910. 일반적으로, 앰프 그람 양성 및 그람 음성 박테리아와 곰 팡이 대 한 매우 광범위 한 호스트 특이성 있고 곤충 어떤 적응 응답10부족 이후 강력한 응답을 제공 해야 합니다. Gloverin 앰프 박테리아와 곰 팡이 대 한 활성 이며 외부 막 형성6,11을 억제. Moricins 막 관통과 기 공9,11을 형성 하 여 그람 양성 및 그람 음성 세균에 대해 항균 기능을 전시 한다. Cecropins는 박테리아와 곰 팡이 대 한 활동을 제공 하 고 moricins9,10처럼 비슷하게 막 permeabilize. Gallerimycin 곰 팡이 방지 속성9defensin 같은 펩 티 드 이다. 흥미롭게도, 그것은 발견 했다 cecropin 및 gallerimycin의 조합 대장균10에 대 한 시너지 활동 했다.
때문에 그들의 사용 하기 쉬운 문자 G. mellonella 애벌레는 세균성 pathogenicity를 평가 하기 위해 종종 사용된 감염 모델입니다. 특히, G. mellonella 에서 얻은 데이터 연구가 대체 호스트 모델의 강도 마우스 지원에서 얻은 데이터와 연관. 그것은 조직의 감염 후 감염 마우스 모델에서의 Listeria monocytogenes 가장 병원 성 serotypes G. mellonella 에서 높은 사망 율에 또한 지도 발견 했다. 또한, 악성 serotypes 덜 밝혀졌다 G. mellonella 모델12에서 보다 적게 악성도 될. 인간 병원 성 균 류 칸디 다 albicans와 비슷한 관찰 되었습니다. 독성 다른 C. albicans 의 종자는 조직의 감염 및 애벌레 생존의 후속 모니터링에 의해 부과 되었습니다. 마우스 avirulent 긴장은 또한 avirulent 또는 전시 마우스 악성 변종 리드 하 고 또한 애벌레 사망률13반면 G. mellonella에 독성을 감소. G. mellonella 모델 추가 녹 농 균14의 유형 3 분 비 시스템 pathogenicity 요소를 식별 하기 위해 사용 될 수 있습니다.
G. mellonella 관련 된 대부분의 조사 조직의 감염 방식을 사용 하 여 독성 요인에 초점을 했다 이후 우리 메서드는 구두 강제로에 장내 공생의 분석에 적합 제공에 특히 흥미 있었다 모델은 우리 수 애벌레 당 박테리아의 다른 복용량을 적용 하 고 뿐만 아니라 애벌레 사망률을 관찰 하지만 장내 항상성 유지를 타고 난 면역 반응의 다른 특징을 분석.
우리의 방법은 우리가 박테리아의 응용 프로그램 및 RNA 발현의 분석을 결합 하는 이후 대체 모델로 G. mellonella 의 사용을 증가 하는 데 도움이 됩니다. 만 때 구강 관리 및 조직의 감염 후 사망률 뿐만 아니라 관찰 후 면역 반응의 분석을 포함 한 세균 병 인 연구의 의미를 강화 하기 위해 유용 하다. 우리의 방법을 수 있습니다 박테리아의 면역성 속성의 분석에 대 한 비 병원 성 공생 이후 살아있는 유기 체에는 장 방 벽을 제공 하 여 세포 배양 보다 더 복잡 한 조건을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
G. mellonella 모델은 조직의 감염 접근21세균 독성 요인 평가 하기 위해 자주 사용된 모델. 이후 많은 병원 균과 박테리아 구두 식민지 또는 감염 경로 통해 호스트를 입력, 새로운 통찰력 G. mellonella 구두 식민과 감염에 대 한 모델로 평가를 찾이 필요가 있다.
G. mellonella 15-37 ° C 사이 가능성은 큰 장점이 있기 때문에 대부분 포유류 모델 37 ° C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 DFG (SPP1656), DFG 연구 훈련 그룹 1708, Bundesministerium 위한 Bildung und Forschung (BMBF) 독일 센터에 의해 감염 연구 (DZIF)에 대 한 투자 되었다.
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
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