В Vivo Трехмерная Двухфотонной Микроскопии для изучения проведенных сосудистых реакций по местному выбросу АТФ с помощью стеклянной микро-пипетки
Summary
Мы представляем оптимизированную локальную процедуру выброса с использованием стеклянной микропипетты и быстрого метода визуализации двухфотонного гиперстога, который позволяет точно измерять изменения диаметра капилляров и исследует его регулирование в трех измерениях.
Abstract
Поддержание нормальной функции мозга требует достаточного и эффективного снабжения кислородом и питанием сложной сетью сосудов. Однако регуляция мозгового кровотока (CBF) понимается неполно, особенно на уровне капилляров. Двухфотоническая микроскопия является мощным инструментом, широко используемым для изучения CBF и его регулирования. В настоящее время эта область ограничена отсутствием в ививо двухфотонных микроскопических исследований, исследующих (1) cbF ответы в трех измерениях, (2) провел сосудистые реакции, и (3) локализованных вмешательств в сосудистой сети. Здесь мы описываем метод 3D in vivo с использованием двухфотонной микроскопии для изучения проведенных сосудистых реакций, вызванных локальным выбросом АТФ со стеклянной микропипеткой. Наш метод использует быструю и повторяющиеся гиперстек двухфотонные изображения, обеспечивающие точные измерения диаметра по максимальной интенсивности проекции полученных изображений. Кроме того, мы показываем, что этот метод также может быть использован для изучения 3D астроцитарных реакций кальция. Мы также обсуждаем преимущества и ограничения вставки стеклянной микропипетты и двухфотонного гиперстакта.
Introduction
Мозг имеет высокий уровень потребления энергии. Около 20% кислорода и 25% глюкозы, потребляемой человеческим телом, предназначены для работы мозга, в то время как мозг занимает только 2% от общей массы тела. Поддержание нормальной функции мозга требует достаточного и эффективного снабжения кислородом и питания кровотоком в сложной сети сосудов. Местная мозговая активность и мозговой кровоток (CBF) надежно связаны, в зависимости от функциональных свойств нейронов, астроцитов, перицитов, гладких мышечных клеток (СМК) и эндотелиальных клеток (ЭК)1. В последнее время первые несколько заказов капилляров, разветвляющихсяиз проникающих артериол, стали «горячей точкой» 2, показывая активную регуляцию капиллярного кровотока. Медленно проводимых сосудистой реакции (CVR) был обнаружен в этой “горячей точке” в мыши соматосенсорной коры во время как стимуляции усов и местного выброса (пыхтя) АТФ со стеклянной микро-пипеткой3.
Хотя in vivo изображений с помощью двухфотонной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии широко используется для изучения нервно-сосудистых реакций в коре головного мозга, большинство исследований измеряли диаметры кровеносных сосудов и исследовали их регуляцию в двухмерная (2D) плоскость x-y. Проблемы: Во-первых, церебральные кровеносные сосуды и их охватывающие астроциты, перициты и СМК строят ветви в трех измерениях (3D). Поэтому очень важно изучить их взаимодействия в 3D. Во-вторых, даже небольшое количество дрейфа в фокусе повлияет на точное измерение как диаметров судов, так и клеточных флуоресцентных сигналов. Наконец, ССЗ быстро и далеко идущие в трех измерениях. 3D-сканирование объема оптимально для обнаружения СВРс и открытия их механизмов. Мы внедрили цель пьезо мотора в двухфотонный микроскоп для изучения соматосенсорной коры мыши in vivo, что позволило точно измерить диаметр максимальной интенсивности проекций полученных изображений.
Стеклянные микро-пипетки часто используются для исследования мозга in vivo, например, для навалом загрузки органических красителей4, записи EEGs5 и для зажима патча6. Тем не менее, ограничения остаются. Как правило, кончик стеклянной микро-пипетки неточно помещается, или микро-пипетка не используется для местных вмешательств. Здесь мы оптимизировали процедуру вставки микропипетты и локального выброса.
Кроме того, сочетание трехфотонной микроскопии и генетически закодированных флуоресцентных индикаторов дает беспрецедентную возможность исследовать нервно-сосудистые связи в 3D сфере. В этом исследовании мы воспользовались этим и ввели вирусные векторы, несущие астроцитные специфические генетически закодированные индикаторы кальция в соматосенсорную кору мыши. Астроциты, а также диаметры судов были изображены одновременно путем объединения различных флуоресцентных маркеров.
В целом, мы представляем оптимизированный метод локального выброса (пыхтя) стеклянным микропипеткой и быстрой двухфотонной гиперстековой визуализацией, которая позволяет точно измерять изменения диаметра капилляров. Кроме того, наш метод предоставляет новый инструмент для одновременного изучения 3D-профилей ответов Ca2 в ответах астроцитов и сосудистого диаметра.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одной из проблем для сосудистых исследований является точное измерение диаметров сосудов. Метод, который мы описываем здесь, использовал моторизованную цель пьезо, чтобы сделать быструю и повторяющееся гиперстек-изображение с помощью двухфотонной микроскопии. Во-первых, этот метод п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Фондом Лундбека, Фондом NOVO-Nordisk, Датским советом независимых исследований Медицинские науки, и грант Фонда NORDEA в Центр здорового старения.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
