Summary

בVivo תלת מימדי 2-פוטון מיקרוסקופית למחקר שנערכו תגובות כלי דם על ידי הוצאה ATP מקומי באמצעות זכוכית מיקרו פיפטה

Published: June 07, 2019
doi:

Summary

אנו מציגים הליך הוצאה מקומית אופטימיזציה באמצעות זכוכית מיקרו-פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack שיטה הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויים בקוטר נימי וחקירה של התקנה שלה בשלושה ממדים.

Abstract

אחזקה של תפקוד המוח הרגיל דורש אספקה מספקת ויעילה של חמצן ותזונה על ידי רשת מורכבת של כלי קיבול. עם זאת, התקנה של זרימת דם מוחית (CBF) הוא מובן לחלוטין, במיוחד ברמת נימי. מיקרוסקופ שני פוטון הוא כלי רב עוצמה הנפוץ לחקר CBF והרגולציה שלה. כיום, שדה זה מוגבל על ידי העדר vivo שני פוטון במחקרים מיקרוסקופ בדיקה (1) התגובות CBF בשלושה מימדים, (2) ביצע תגובות כלי דם, ו (3) התערבויות מקומיות בתוך הרשת כלי הדם. כאן, אנו מתארים 3D בשיטה vivo באמצעות שני-פוטון מיקרוסקופ למחקר שנערכו תגובות כלי דם הרוויח על ידי הוצאה מקומית של ATP עם מיקרו פיפטה זכוכית. השיטה שלנו משתמשת hyperstack מהיר וחוזר הדמיה שני-פוטון מתן מדידות בקוטר מדויק על ידי הקרנת עוצמה מקסימלית של התמונות שהתקבלו. יתר על כן, אנו מראים כי שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור תגובות astrocytic סידן 3D. אנו דנים גם את היתרונות והמגבלות של החדרת מיקרו-פיפטה זכוכית, שני פוטון hyperstack הדמיה.

Introduction

למוח יש שיעור צריכת אנרגיה גבוהה. כ-20% מהחמצן ו -25% מהגלוקוז הנצרך על ידי גוף האדם מוקדשים לתפקוד מוחי, בעוד המוח תופס רק 2% ממסת הגוף הכוללת. אחזקה של תפקוד המוח הרגיל דורש אספקה מספקת ויעילה של חמצן ותזונה על ידי זרימת הדם ברשת מורכבת של כלי קיבול. פעילות מוחית מקומית וזרימת דם מוחית (cbf) הם מכבש בהתאם למאפיינים הפונקציונליים של נוירונים, אסטרוציטים, קרום הלב, תאים שריר חלק (smcs) ותאי האנדותל (ecs)1. לאחרונה, ההוראות הראשונות של נימים מסתעפת מפני חדירה בתוך העורקים הופיעו כ-“נקודה חמה”2, מראה התקנה פעילה של זרימת דם נימי. תגובה איטית של כלי הדם (CVR) התגלתה ב נקודה חמה זו בקליפת המגע של העכבר במהלך גירוי הויקר והפליטה המקומית (לעשן) של ATP עם מיקרו פיפטה מזכוכית3.

למרות בvivo הדמיה של שני פוטון לייזר סריקה מיקרוסקופ פלורסנט כבר בשימוש נרחב ללמוד תגובות נוירונימי בקליפת מוחין, רוב המחקרים שנמדדו בכלי הדם קטרים וחקר הרגולציה שלהם ב מישור x-y דו-ממדי (2D). האתגרים הם: ראשית, כלי דם מוחין והאסטרוציטים החובק שלהם, קרום הלב ו SMCs לבנות ענפים בשלושה ממדים (3D). לכן חשוב ללמוד את האינטראקציות שלהם ב-3D. שנית, אפילו כמות קטנה של סחיפה בפוקוס ישפיע על המדידה המדויקת של שני קטרים ואותות פלורסנט סלולריים. לבסוף, CVRs הם מהירים ומרחיקי לכת בשלושה מימדים. סריקת נפח תלת-ממד היא אופטימלית לזיהוי CVRs וחשיפת המנגנונים שלהם. אנו הטמיעה מטרה piezo מנוע במיקרוסקופ שני פוטון ללמוד קליפת המגע של העכבר בvivo, המאפשר מדידות קוטר מדויק על ידי התחזיות אינטנסיביות מקסימלית של התמונות שהתקבלו.

זכוכית מיקרו-פיפטות לעתים קרובות נעשה שימוש במחקרים במוח vivo, למשל, כדי לטעון בצובר צבעים אורגניים4, שיא eegs5 ועבור תיקון לסדר6. עם זאת, נותרו מגבלות. בדרך כלל, הקצה של מיקרו פיפטה זכוכית הוא imprecisely ממוקם, או מיקרו פיפטה לא משמש התערבויות מקומיות. כאן, יש לנו אופטימיזציה ההליך של החדרת מיקרו פיפטה והוצאה מקומית.

יתר על כן, השילוב של 3D two-פוטון מיקרוסקופ ו מקודד גנטית מחוונים פלורסנט מציע הזדמנות חסרת תקדים לחקור צימוד וסקולרית בטווח תלת-ממד. במחקר זה, ניצלנו את זה והזריקו וקטורים ויראליות נושאת מחווני סידן מהונדסים גנטית מסוימת לתוך קליפת המגע של העכבר. האסטרוציטים כמו גם קטרים של כלי היו התמונה בו על ידי שילוב סמנים פלורסנט שונים.

באופן כללי, אנו מציגים שיטה ממוטבת של הוצאה מקומית (לעשן) על ידי זכוכית מיקרו פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויי קוטר נימי. בנוסף, השיטה שלנו מספקת כלי הרומן ובמקביל לחקור פרופילי 3d של Ca2 + תגובות אסטרוציטים ו בקוטר כלי דם תגובות.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הלאומית הדנית לפי ההנחיות שנקבעו באמנת המועצה האירופית להגנת בעלי חיים בעלי חוליות המשמשים למטרות נסיוניות ומדעיות אחרות. היו בהתאם להנחיות הגעה. זהו נוהל מסוף עם העכברים להיות מורדמים לפני התאוששות הרדמה. <p class="jove_…

Representative Results

לאחר הניתוח הושלם, עכברים הועברו למיקרוסקופ שני פוטון (איור 1א). מיקרו פיפטה זכוכית המכילה 1 מ”מ ATP הוכנס בסמיכות לכלי הדם של היעד במיקום היעד (איור 1B). ביצעו היפרסטאק הדמיה תוך מתן מציצה של 1 מ ל ATP (איור 2a</str…

Discussion

אתגר אחד עבור לימודי כלי דם הוא המדידה המדויקת של קטרים הספינה. השיטה שאנו מתארים כאן השתמשו מטרה piezo ממונע להפוך מהיר וחוזר הדמיה היפרסטאק על ידי שני פוטון מיקרוסקופ. ראשית, שיטה זו מאפשרת בדיקות חוזרות של הarteriole חודר, 1 לסדר ו-2 נימים הזמנה ללא אובדן של מיקוד והובילו לגילוי של לאט ביצע…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרן לוננבק, קרן נובו-נורדיסק, המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הרפואה ומלגת קרן נורDEA למרכז להזדקנות בריאה.

Materials

Agarose Sigma–Aldrich A6138 Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594 Life Technologies A-10438 Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP Sigma-Aldrich A9187 Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator Loctite Adhesives and SF7452 Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD500S Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice Jackson Laboratory 8241 These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f Addgene 52924-AAV5 Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran Sigma-Aldrich 52194 Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump WPI PV830 Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer Radiometer ABL 700 Measure levels of blood gases 
Blood pressure monitor World Precision Instruments BP-1 Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller CWE Model TC-1000 Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph Harvard Apparatus Type 340 Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator A.M.P.I. ISO-flex Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator Harvard Apparatus D-79232 Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Two-photon microscope Femtonics Ltd Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer  Lawton 09-0007
Angled and balanced tweezer S&T AG 00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor Lawton 05-1450
Micro vascular clamp S&T AG 462
Mouse vascular catheters Verutech 100828

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  3. Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
  4. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  5. Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
  6. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
  7. Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
  8. Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
  9. Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
  10. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  11. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
  12. Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
  13. Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
  14. Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).

Play Video

Cite This Article
Cai, C., Zambach, S. A., Fordsmann, J. C., Lønstrup, M., Thomsen, K. J., Jensen, A. G. K., Lauritzen, M. In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette. J. Vis. Exp. (148), e59286, doi:10.3791/59286 (2019).

View Video