Vivo में तीन-आयाम दो-फोटो माइक्रोस्कोपी अध्ययन करने के लिए स्थानीय एटीपी इंजेक्शन द्वारा एक ग्लास माइक्रो-पिपेट का उपयोग करके संवहनी जवाब आयोजित
Summary
हम एक अनुकूलित स्थानीय निष्कासन प्रक्रिया एक गिलास माइक्रो-पिपेट और एक तेजी से दो-फोटोन हाइपरस्टैक इमेजिंग विधि का उपयोग करके प्रस्तुत करते हैं, जो केशिका व्यास परिवर्तन और तीन आयामों में इसके विनियमन की जांच की सटीक माप की अनुमति देता है।
Abstract
सामान्य मस्तिष्क समारोह के रखरखाव जहाजों के एक जटिल नेटवर्क द्वारा ऑक्सीजन और पोषण की एक पर्याप्त और कुशल आपूर्ति की आवश्यकता है. हालांकि, मस्तिष्क रक्त प्रवाह (सीबीएफ) के विनियमन को अधूरा समझा जाता है, विशेष रूप से केशिका स्तर पर। दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग सीबीएफ और इसके विनियमन का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है। वर्तमान में, इस क्षेत्र में की कमी से सीमित है vivo दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी अध्ययन की जांच (1) तीन-आयामों में CBF प्रतिक्रियाओं, (2) संवहनी प्रतिक्रियाओं का आयोजन किया, और (3) संवहनी नेटवर्क के भीतर स्थानीयकृत हस्तक्षेप. यहाँ, हम एक गिलास माइक्रो-पिपेट के साथ एटीपी के स्थानीय निष्कासन द्वारा प्रकाश में लाया संवहनी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विवो विधि में एक 3 डी का वर्णन। हमारी विधि प्राप्त छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण द्वारा सटीक व्यास माप प्रदान तेजी से और दोहराव hyperstack दो-फोटोन इमेजिंग का उपयोग करता है. इसके अलावा, हम बताते हैं कि इस विधि भी 3 डी astrocytic कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम कांच के माइक्रो-पिपेट प्रविष्टि और दो-फोटोन हाइपरस्टैक इमेजिंग के फायदे और सीमाओं पर भी चर्चा करते हैं।
Introduction
मस्तिष्क एक उच्च ऊर्जा की खपत दर है. ऑक्सीजन के बारे में 20% और मानव शरीर द्वारा भस्म ग्लूकोज का 25% मस्तिष्क समारोह के लिए समर्पित कर रहे हैं, जबकि मस्तिष्क केवल कुल शरीर द्रव्यमान का 2% रह रहे हैं. सामान्य मस्तिष्क समारोह के रखरखाव के लिए जहाजों के एक जटिल नेटवर्क में रक्त प्रवाह द्वारा ऑक्सीजन और पोषण की पर्याप्त और कुशल आपूर्ति की आवश्यकता होती है। स्थानीय मस्तिष्क गतिविधि और मस्तिष्क रक्त प्रवाह (सीबीएफ) मजबूत युग्मित कर रहे हैं, न्यूरॉन्स के कार्यात्मक गुणों पर निर्भर करता है, astrocytes, pericytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (SMCs) और endothelial कोशिकाओं (ईसी)1. हाल ही में, मर्मज्ञ धमनी से शाखा के केशिकाओं के पहले कुछ आदेश एक ‘हॉटस्पॉट’2के रूप में उभरा है, जो केशिका रक्त प्रवाह के सक्रिय विनियमन को दर्शाता है। एक धीमी गति से आयोजित संवहनी प्रतिक्रिया (सीवीआर) माउस somatosensory प्रांतस्था में इस ‘हॉटस्पॉट’ पर दोनों whisker उत्तेजना और एक गिलास माइक्रो-पिपेट3के साथ एटीपी के स्थानीय निष्कासन (puffing) के दौरान की खोज की थी.
हालांकि दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा विवो इमेजिंग में व्यापक रूप से सेरेब्रल कॉर्टेक्स में neurovascular प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अध्ययन के अधिकांश रक्त वाहिका व्यास मापा और एक में उनके विनियमन की जांच की द्वि-आयामी (2डी) x-y विमान. चुनौतियां हैं: सबसे पहले, सेरेब्रल रक्त वाहिकाओं और उनके गले लगाने एस्ट्रोसाइट्स, pericytes और SMCs तीन आयामों (3 डी) में शाखाओं का निर्माण. इसलिए यह 3 डी में उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. दूसरे, यहां तक कि ध्यान में बहाव की एक छोटी राशि दोनों पोत व्यास और सेलुलर फ्लोरोसेंट संकेतों का सटीक माप को प्रभावित करेगा. अंत में, CVRs तेजी से और तीन आयामों में दूरगामी हैं. 3 डी मात्रा स्कैनिंग CVRs का पता लगाने और उनके तंत्र का अनावरण करने के लिए इष्टतम है। हम एक दो-फोटोन माइक्रोस्कोप में एक piezo मोटर उद्देश्य लागू करने के लिए vivo में माउस somatosensory प्रांतस्था का अध्ययन, प्राप्त छवियों की अधिकतम तीव्रता अनुमानों द्वारा सटीक व्यास माप की अनुमति.
ग्लास माइक्रो-पिपेट्स का उपयोग विवो मस्तिष्क अध्ययन में अक्सर किया जाता है, उदाहरण के लिए, थोक-लोड कार्बनिक रंगोंकेलिए 4, रिकॉर्ड ईईजी5 और पैच क्लैम्पिंग6के लिए। फिर भी, सीमाएं बनी हुई हैं। आम तौर पर, कांच माइक्रो-पिपेट की नोक को imprecisely रखा जाता है, या स्थानीय हस्तक्षेप के लिए माइक्रो-पिपेट का उपयोग नहीं किया जाता है। यहाँ, हम माइक्रो-पिपेट प्रविष्टि और स्थानीय निष्कासन की प्रक्रिया को अनुकूलित किया है।
इसके अलावा, 3 डी दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी और आनुवंशिक रूप से एनकोडेड फ्लोरोसेंट संकेतक ों का संयोजन 3 डी दायरे में न्यूरोवास्कुलर युग्मन की जांच करने का एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान करता है। इस अध्ययन में, हम इस का लाभ उठाया और वायरल वैक्टर इंजेक्शन astrocyte विशिष्ट आनुवंशिक रूप से encoded कैल्शियम संकेतक ों माउस somatosensory प्रांतस्था में ले. Astrocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पोत व्यास विभिन्न फ्लोरोसेंट मार्करों के संयोजन के द्वारा एक साथ छवि थे.
कुल मिलाकर, हम कांच माइक्रो-पिपेट और तेजी से दो-फोटोन हाइपरस्टैक इमेजिंग द्वारा स्थानीय निष्कासन (पफिंग) की एक अनुकूलित विधि पेश करते हैं, जो केशिका व्यास परिवर्तन के सटीक माप की अनुमति देता है। इसके अलावा, हमारी विधि एक साथ एस्ट्रोसाइट्स और संवहनी व्यास प्रतिक्रियाओं में Ca2 + प्रतिक्रियाओं के 3 डी प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संवहनी अध्ययन के लिए एक चुनौती पोत व्यास का सटीक माप है. विधि हम यहाँ का वर्णन एक motorized piezo उद्देश्य दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी द्वारा तेजी से और दोहराव hyperstack इमेजिंग बनाने के लिए इस्तेमाल किया. सबसे पहले, इस विध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन Lundbeck फाउंडेशन, नोवो-नॉरडिस्क फाउंडेशन, स्वतंत्र अनुसंधान के लिए डेनिश परिषद द्वारा समर्थित किया गया था | चिकित्सा विज्ञान, और NORDEA फाउंडेशन अनुदान स्वस्थ उम्र बढ़ने के लिए केंद्र के लिए.
Materials
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
