Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 in una pianta commestibile.

Abstract

L’agricoltura molecolare vegetale è l’uso delle piante per produrre molecole di interesse. In questa prospettiva, piante possono essere utilizzati sia come bioreattori per la produzione e la successiva purificazione del prodotto finale e per la consegna orale diretta delle proteine eterologhe quando utilizzo di specie vegetali commestibili. In questo lavoro, vi presentiamo lo sviluppo di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 (T1D) nei sistemi di pianta commestibile utilizzando la tecnologia di pianta decostruito basati sul virus del DNA ricombinante, consegnata con infiltrazione vuoto. I nostri risultati indicano che una barbabietola rossa è un host adatto per l’espressione transitoria di un autoantigen derivato umano associato al T1D, considerato un candidato promettente come un vaccino di T1D. Foglie producendo il autoantigen accuratamente sono stati caratterizzati per la loro resistenza alla digestione gastrica, per la presenza di carica batterica residua e per il loro profilo metabolico secondario, dando una panoramica del processo produttivo per l’uso potenziale di piante per la consegna orale diretta di una proteina eterologa. La nostra analisi ha mostrato quasi completa degradazione del vaccino candidato liofilizzato orale seguendo una digestione gastrica simulata, suggerendo che è necessaria una strategia di incapsulamento nella fabbricazione del vaccino GAD pianta-derivati.

Introduction

Dopo la rivoluzione di biologia molecolare vegetale del 1980, sistemi basati su impianto per la produzione di prodotti biofarmaceutici possono essere considerati come un’alternativa ai sistemi tradizionali basati su cellule microbiche e mammiferi¹. Piante mostrano diversi vantaggi rispetto ai tradizionali piattaforme, con scalabilità, economicità e sicurezza essendo il più rilevanti². Il prodotto ricombinante può essere purificato da tessuti vegetali trasformati e quindi somministrato, sia per via parenterale o per via orale e, inoltre, trasformata pianta commestibile può essere utilizzata direttamente per la consegna orale. Via orale contemporaneamente promuove l’immunità mucosa e sistemica, ed elimina la necessità per gli aghi e personale medico specializzato. Inoltre, la consegna orale Elimina la complessa elaborazione a valle, che normalmente rappresenta l’80% del costo totale di produzione di una proteina ricombinante³. Tutti questi vantaggi possono essere tradotte in risparmio in produzione, di forniture e di lavoro riducendo i costi di ogni dose, rendendo il farmaco a prezzi accessibili alla maggior parte della popolazione mondiale.

Diverse strategie, sia per la trasformazione stabile ed espressione transitoria, sono state sviluppate per la produzione di proteine ricombinanti in pianta. Fra loro, un sistema di espressione basata su virus ad alto rendimento decostruito pianta (per esempio, magnICON) fornisce prestazioni superiori che portano alti rendimenti di proteine ricombinanti sulle scale cronologiche relativamente breve⁴. Molti esempi di espressione transiente utilizzando il sistema di espressione basata su virus vegetali in piante di Nicotiana benthamiana sono segnalati, essendo l’host di produzione aurea. Tuttavia, questa pianta di modello non è considerata una specie commestibile a causa gli alcaloidi e altri metaboliti tossici che si accumulano nelle sue foglie.

In questo lavoro descriviamo il confronto tra due sistemi di pianta commestibile, barbabietola rossa (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) e spinaci (Spinacea oleracea cv Industria), per l’espressione delle due forme di candidato dell’isoforma 65 kDa di acido glutammico decarbossilasi (GAD65), l’impianto basato su virus vettori⁵. GAD65 è un autoantigen principale associato al diabete di tipo 1 (T1D) ed è attualmente sotto inchiesta nei test clinici umani per impedire o ritardare il T1D inducendo tolleranza⁶. La produzione di GAD65 nelle piante è stata studiata estesamente in specie di piante modello come Nicotiana tabacum e benthamiana N.^4,5,6,7. Qui, descriviamo l’uso di specie vegetali commestibili per la produzione della molecola nei tessuti che può essere destinata per una consegna orale diretta. Da un punto di vista tecnico, abbiamo studiato e selezionato il sistema per pianta agroinfiltrazione e la piattaforma di pianta commestibile per la produzione di GAD65 valutando diversi parametri: livelli di espressione della proteina ricombinante, la carica microbica residua nell’impianto tessuto significato per somministrazione orale, la resistenza di GAD65 alla digestione gastrica e la bioequivalenza delle piante trasformate con il tipo selvaggio.

Protocol

1. rossa coltivazione di bietola e spinaci Coltivare la barbabietola rossa (b. vulgaris cv Moulin Rouge) e spinaci (S. oleracea cv Industria) piante in una camera di crescita, utilizzando 150 µE di intensità della luce, 65% di umidità relativa, ciclo luce/buio di 12 h a 23/21 ° C, rispettivamente. Dopo la germinazione dei semi, fertilizzare le piante due volte a settimana con una soluzione di 1 g/L di un fertilizzante disponibile in commercio (Tabella materiali)….

Representative Results

In questo lavoro, il flusso di lavoro per lo sviluppo di un vaccino orale nei tessuti vegetali commestibili è presentato. Il focus di questo lavoro è l’espressione di una proteina dell’obiettivo in una specie di pianta commestibile host e la caratterizzazione del potenziale vaccino orale. Il primo passo ha coinvolto la valutazione dell’idoneità della tecnologia di espressione basata su virus della centrale per la produzione d…

Discussion

In questo studio abbiamo mostrato analisi preliminare per la progettazione di un candidato vaccino orale per il diabete autoimmune. La proteina dell’obiettivo per questo esperimento era una forma mutata dell’umana 65 kDa glutammato decarbossilasi, quali produzione e funzionalità sono facilmente rilevabili e misurabili¹². Sua espressione nei tessuti vegetali commestibili diversi è stata mediata da vettori⁵, che mediare un elevato livello di produzione di proteine ricombina…

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	–	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	–	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	–	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	–	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	–	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	–	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	–	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	–	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	–
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade