Forbigående udtryk i rødbede biofarmaceutiske kandidat vaccine til Type 1 Diabetes

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at producere en oral vaccine kandidat mod Type 1 diabetes i en spiselig plante.

Abstract

Plante molekylært landbrug er brugen af planter til at producere molekyler af interesse. I dette perspektiv, kan planter bruges både som bioreaktorer til produktion og efterfølgende rensning af det endelige produkt og for den direkte mundtlige levering af heterolog proteiner ved brug af spiselige plantearter. I dette arbejde præsenterer vi udviklingen af en kandidat oral vaccine mod Type 1 Diabetes (T1D) i spiselige plante systemer ved hjælp af dekonstrueret plante virus-baseret rekombinant DNA-teknologi, leveret med vakuum infiltration. Vores resultater viser, at en rødbede er en passende vært for forbigående udtryk for en menneskelig afledte autoantigen knyttet til T1D, anses for at være en lovende kandidat som en T1D vaccine. Bladene producerer autoantigen blev grundigt karakteriseret for deres modstand mod gastrisk fordøjelse, for tilstedeværelsen af resterende bakteriel afgift og for deres sekundære metaboliske profil, giver en oversigt over processen for den potentielle anvendelse af planter til direkte oral levering af en heterolog protein. Vores analyse viste næsten fuldstændig nedbrydning af den frysetørrede kandidat oral vaccine efter en simuleret gastrisk fordøjelse, tyder på, at en indkapsling strategi til fremstilling af plantebaserede GAD vaccine er påkrævet.

Introduction

Siden anlægget Molekylærbiologi revolution i 1980 ‘ erne, kan plante-baserede systemer til produktion af biopharmaceuticals betragtes som et alternativ til traditionelle systemer baseret på mikrobiel og mammale celler¹. Planter viser flere fordele frem for traditionelle platforme, med skalerbarhed, omkostningseffektivitet og sikkerhed at blive den mest relevante². Den rekombinante produkt kan renset fra transformerede plantevæv og derefter administreres, enten parenteralt eller mundtligt og i øvrigt transformeret spiselige plante kan bruges direkte til oral levering. Den mundtlige rute fremmer samtidig slimhinde og systemisk immunitet, og det fjerner behovet for nåle og specialiseret medicinsk personale. Derudover eliminerer oral levering den komplekse downstream behandling, som normalt tegner sig for 80% af de samlede produktionsomkostninger af en rekombinant protein³. Alle disse fordele kan oversættes til besparelser i produktion, levering og arbejdskraft at reducere omkostningerne i forbindelse med hver dosis, gør stoffet overkommelig for de fleste af verdens befolkning.

Flere strategier, både for stabil transformation og forbigående udtryk, var udviklet til fremstilling af rekombinante proteiner i planter. Blandt dem giver en højtydende dekonstrueret plante virus-baseret udtryk system (f.eks. magnICON) overlegen ydeevne fører høje udbytter af rekombinante proteiner over relativt korte tidsfrister⁴. Mange eksempler på forbigående udtryk ved hjælp af planten virus-baseret udtryk system i Nicotiana benthamiana planter er rapporteret, at være guldstandarden produktion vært. Denne model plante betragtes ikke som en spiselige arter på grund af alkaloider og andre toksiske metabolitter, der er akkumuleret i sine blade.

I dette arbejde, beskriver vi sammenligning mellem to spiselige plante systemer, rødbede (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (Spinacea oleracea cv Industria), for at give udtryk for to kandidat 65 kDa isoform af glutaminsyre decarboxylase (GAD65), udført af planten virus-baseret vektorer⁵. GAD65 er et større autoantigen forbundet til Type 1 Diabetes (T1D) og det er i øjeblikket under efterforskning i humane kliniske forsøg til at forhindre eller forsinke T1D ved at inducere tolerance⁶. Produktionen af GAD65 i planter er blevet grundigt undersøgt i modellen plantearter som Nicotiana tabacum og N. benthamiana^4,5,6,7. Her, beskriver vi brugen af spiselige plantearter til produktion af molekyle i væv, der kan være beregnet til en direkte oral levering. Fra et teknisk synspunkt, vi studeret og valgt system for planten agroinfiltration og spiselige plante platform for GAD65 produktion ved at evaluere forskellige parametre: udtrykket rekombinante protein niveauer, de resterende mikrobielle afgift i anlægget væv beregnet til oral levering, modstanden i GAD65 til gastrisk fordøjelsen og bioækvivalens af de transformerede planter med wild-type.

Protocol

1. røde sukkerroer og spinat dyrkning Vokse rødbede (B. vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (S. oleracea cv Industria) planter i et vækst kammer, med 150 µE af lysintensitet, 65% relativ luftfugtighed, 12 h lys/mørke cyklus på 23/21 ° C, hhv. Efter frø spiring, befrugte planter to gange om ugen med en 1 g/L opløsning af et kommercielt tilgængelige gødning (Tabel af materialer). Brug fem uger gamle spinat og seks uger gamle rødbede planter til agroinfiltra…

Representative Results

I dette arbejde præsenteres for udviklingen af en oral vaccine i spiselige plantevæv arbejdsgang. Fokus for dette arbejde er udtryk for et mål protein i en spiselig vært plantearter og karakterisering af den potentielle oral vaccine. Det første trin involveret evaluering af egnetheden af plante virus-baseret udtrykket teknologi til at producere rekombinante proteiner i spiselige plante systemer. Til dette formål, vi først…

Discussion

I denne undersøgelse viste vi foreløbig analyse for udformningen af en kandidat oral vaccine for autoimmune diabetes. Target proteinet for dette eksperiment var en muteret form for den menneskelige 65 kDa glutamat Decarboxylase, hvilke produktions- og funktionalitet er let påviselige og målbare¹². Dens udtryk i forskellige spiselige plantevæv blev formidlet af vektorer⁵, der mægle et højt niveau af rekombinante protein produktion i en meget kort tidsramme. Udvælgels…

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	–	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	–	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	–	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	–	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	–	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	–	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	–	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	–	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	–
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade