Hier presenteren we een protocol voor de productie van een kandidaat van de orale vaccin tegen Type 1 diabetes in een eetbare plant.
Plant moleculaire landbouw is het gebruik van planten voor de productie van moleculen van belang. In dit perspectief moet kunnen planten gebruikt worden als bioreactoren voor de productie en de daaropvolgende zuivering van het eindproduct en de directe mondelinge levering van heterologe eiwitten bij het gebruik van eetbare plantensoorten. In dit werk presenteren wij de ontwikkeling van een kandidaat-orale vaccin tegen Type 1 Diabetes (T1D) in de eetbare plant-systemen die gebruikmaken van gedeconstrueerd plant virus gebaseerde recombinant DNA-technologie, geleverd met vacuüm infiltratie. Onze resultaten tonen aan dat een rode biet een geschikte gastheer voor de voorbijgaande expressie van een mens afgeleide autoantigen gekoppeld aan T1D is, beschouwd als een veelbelovende kandidaat als een T1D vaccin. Bladeren produceren de autoantigen werden grondig gekenmerkt voor hun verzet tegen de maag spijsvertering, de aanwezigheid van residuele bacteriële lading en hun secundaire metabole profiel, met een overzicht van het productie proces voor de potentiële gebruik van planten voor de directe mondelinge aflevering van een heteroloog eiwit. Onze analyse toonde bijna volledige afbraak van het gevriesdroogd kandidaat-orale vaccin na een gesimuleerde maag spijsvertering, suggereert dat een strategie van de inkapseling bij de vervaardiging van de GAD plantgerelateerde vaccin vereist is.
Sinds de plant moleculaire biologie revolutie in de jaren 1980, kunnen plant gebaseerde systemen voor de productie van biofarmaceutica worden beschouwd als een alternatief voor traditionele systemen gebaseerd op microbiële en zoogdieren cellen1. Planten display verscheidene voordelen over traditionele platformen, met schaalbaarheid, kosteneffectiviteit en veiligheid wordt de meest relevante2. De recombinante product kan worden gezuiverd van getransformeerde plant weefsel en vervolgens beheerd, ofwel parenteraal of mondeling en, bovendien, getransformeerde eetbare plant direct voor mondelinge levering kan worden gebruikt. Orale toediening bevordert tegelijkertijd mucosal en systemische immuniteit, en het elimineert de noodzaak voor naalden en gespecialiseerde medisch personeel. Bovendien elimineert mondelinge levering de complexe downstream processing, die normaal goed is voor 80% van de totale productiekosten van een recombinant eiwit3. Al deze voordelen kunnen worden vertaald in besparingen in leveringen, productie en arbeid reduceert de kosten van elke dosis, waardoor de drug betaalbaar voor de meeste van de wereldbevolking.
Verschillende strategieën, zowel voor stabiele transformatie en voorbijgaande expressie, werden ontwikkeld voor de productie van recombinante eiwitten in planten. Onder hen biedt een hoog rendement gedeconstrueerd plant virus gebaseerde expressie systeem (bijvoorbeeld magnICON) superieure prestaties leidt hoge opbrengsten van recombinante eiwitten over relatief korte tijdschalen4. Vele voorbeelden van voorbijgaande expressie met behulp van de plant virus gebaseerde expressie systeem in Nicotiana benthamiana planten worden gerapporteerd, wordt de goudstandaard productie host. Deze plant model wordt echter niet beschouwd als een eetbare soorten als gevolg van de alkaloïden en andere giftige metabolieten die zijn verzameld in zijn bladeren.
In dit werk, beschrijven we de vergelijking tussen twee eetbare plant systemen, rode biet (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) en spinazie (oleracea Spinacea cv Industria), voor de expressie van twee kandidaat-vormen van de isovorm 65 kDa van glutaminezuur decarboxylase (GAD65), uitgevoerd door de plant virus gebaseerde vectoren5. GAD65 is een grote autoantigen geassocieerd met Type 1 Diabetes (T1D) en het wordt momenteel onderzocht in klinische testen te voorkomen of vertragen T1D door inducerende tolerantie6. De productie van GAD65 in planten is uitgebreid onderzocht bij model plantensoorten als Nicotiana tabacum en N. benthamiana4,5,6,7. Hier beschrijven we het gebruik van eetbare planten voor de productie van de molecule in weefsels die kunnen worden bedoeld voor een mondelinge bericht direct te bezorgen. Vanuit een technisch oogpunt, we onderzocht en geselecteerd van het systeem voor agroinfiltration van de plant en de eetbare plant-platform voor de productie van GAD65 met een evaluatie van verschillende parameters: de recombinant eiwit expressie niveaus, de resterende microbiële lading in plant weefsels bedoeld voor mondelinge levering, de weerstand van GAD65 naar de maag spijsvertering, en de biologische equivalentie van de getransformeerde planten met de wild-type.
In deze studie toonden we voorlopige analyse voor het ontwerp van een kandidaat-orale vaccin voor auto-immuunziekte diabetes. De proteïne van de doelgroep voor dit experiment was een gemuteerde vorm van het menselijke 65 kDa glutamaat Decarboxylase, welke productie en functionaliteit zijn dan gemakkelijk waarneembare en meetbare12. De expressie in de weefsels van verschillende eetbare plant was gemedieerd door de vectoren5, die een hoog niveau van de productie van recombin…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door het gezamenlijke Project “Het gebruik van planten voor de productie van een auto-immuunziekte diabetes eetbare vaccin (eDIVA)” (Project-ID: 891854) door de Universiteit van Verona, in het kader van de oproep 2014 gefinancierd.
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
C18 Column | Grace | – | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
C18 Guard Column | Grace | – | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
Chloroform | Sigma | C2432 | |
Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
HILIC Column | Grace | – | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
HILIC Guard Column | Grace | – | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
HPLC Autosampler | Beckman Coulter | – | System Gold 508 Autosampler |
HPLC System | Beckman Coulter | – | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
Loading Buffer | |||
Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
Mass Spectometer | Bruker Daltonics | – | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
Methanol | Sigma | 32213 | |
MgSO4 | Sigma | M7506 | |
Milk-blocking solution | Ristora | – | 3 % in PBS |
Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
Syringe | Terumo | – | |
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |