Expresión transitoria en remolacha roja de una vacuna candidata biofarmacéutica para la Diabetes tipo 1

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para producir a un candidato de vacuna oral contra la diabetes tipo 1 en una planta comestible.

Abstract

Planta la agricultura molecular es el uso de plantas para producir moléculas de interés. En esta perspectiva, las plantas pueden utilizarse tanto como biorreactores para la producción y purificación posterior del producto final y para la administración oral directa de proteínas heterólogas al utilizar especies de plantas comestibles. En este trabajo presentamos el desarrollo de la vacuna oral contra la Diabetes de tipo 1 (T1D) candidato en sistemas de plantas comestibles utilizando tecnología del ADN recombinante basado en el virus de la planta deconstruido, entregada con infiltración vacío. Nuestros resultados muestran que una remolacha roja es un huésped adecuado para la expresión transitoria de un autoantígeno derivada humana asociada a T1D, considerado como un candidato prometedor como vacuna T1D. Hojas produciendo el autoantígeno bien se caracterizaron por su resistencia a la digestión gástrica, la presencia de carga bacteriana residual y su perfil metabólico secundario, dando una visión general de la producción de proceso para el uso potencial de las plantas para administración oral directa de una proteína heteróloga. Nuestro análisis demostró la degradación casi completa de la vacuna oral liofilizada candidato tras una digestión gástrica simulada, lo que sugiere que una estrategia de encapsulación en la fabricación de la vacuna de GAD de origen vegetal se requiere.

Introduction

Desde la revolución de biología molecular de plantas en la década de 1980, los sistemas basados en plantas para la producción de biofármacos pueden considerarse como una alternativa a los sistemas tradicionales basados en células microbianas y mamíferos¹. Las plantas muestran varias ventajas sobre las plataformas tradicionales, con escalabilidad, eficacia y seguridad, siendo los más relevantes². El producto recombinante puede ser purificado a partir de tejido vegetal transformado y entonces administrado, ya sea por vía parenteral o por vía oral y, además, transformada de plantas comestibles se pueden utilizar directamente para administración oral. La vía oral al mismo tiempo promueve la inmunidad mucosa y sistémica, y elimina la necesidad de agujas y personal médico especializado. Además, la administración oral elimina el complejo proceso aguas abajo, que normalmente representa el 80% del costo total de fabricación de una proteína recombinante³. Todas esas ventajas se pueden traducir en un ahorro en la producción, insumos y mano de obra reduciendo los costos de cada dosis, lo que el fármaco asequibles a la mayoría de la población mundial.

Varias estrategias, tanto para la transformación estable y expresión transitoria, fueron desarrolladas para la producción de proteínas recombinantes en plantas. Entre ellos, un sistema de expresión basados en virus de planta deconstruido de alto rendimiento (por ejemplo, magnICON) proporciona funcionamiento superior conduce a altos rendimientos de proteínas recombinantes sobre escalas de tiempo relativamente corto⁴. Se reportan muchos ejemplos de expresión transitoria mediante el sistema de expresión basados en virus vegetales en plantas de Nicotiana benthamiana , siendo el host de producción estándar de oro. Sin embargo, esta planta de modelo no se considera como una especie comestible debido a los alcaloides y otros metabolitos tóxicos que se acumulan en sus hojas.

En este trabajo, describimos la comparación entre dos sistemas de la planta comestible, remolacha roja (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) y espinacas (Spinacea oleracea cv Industria), para la expresión de dos formas de candidato de la isoforma 65 kDa de ácido glutámico decarboxilasa (GAD65), llevado a cabo por la planta basada en virus vectores⁵. GAD65 es un autoantigen importante asociado a Diabetes de tipo 1 (T1D) y actualmente está bajo investigación en ensayos clínicos en humanos para prevenir o retrasar la T1D induciendo tolerancia⁶. La producción de GAD65 en plantas se ha estudiado extensivamente en especies modelo como Nicotiana tabacum y N. benthamiana^4,5,6,7. Aquí, describimos el uso de especies de plantas comestibles para la producción de la molécula en los tejidos que puede significar para una administración oral directa. Desde un punto de vista técnico, estudia y selecciona el sistema de planta agroinfiltration y la plataforma de plantas comestibles para la producción de GAD65 mediante la evaluación de diferentes parámetros: los niveles de la expresión de proteína recombinante, la carga microbiana residual en la planta tejido para administración oral, la resistencia de GAD65 en la digestión gástrica y la bioequivalencia de las plantas transformadas con el tipo salvaje.

Protocol

1. rojo cultivo de remolacha y espinacas Cultivar la remolacha roja (B. vulgaris cv Moulin Rouge) y espinacas (S. oleracea cv Industria) plantas en una cámara de crecimiento, con 150 µE de intensidad de luz, humedad relativa de 65%, ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 23/21 ° C, respectivamente. Después de la germinación de la semilla, fertilizar las plantas dos veces a la semana con una solución de 1 g/L de fertilizante disponible en el mercado (Tabla de materiales</stron…

Representative Results

En este trabajo se presenta el flujo de trabajo para el desarrollo de una vacuna oral en los tejidos vegetales comestibles. El enfoque de este trabajo es la expresión de una proteína de la blanco en una especie vegetal comestible y la caracterización de la potencial vacuna oral. El primer paso implicó la evaluación de la idoneidad de la tecnología de expresión basada en el virus de la planta para producir proteínas recom…

Discussion

En este estudio mostramos análisis preliminar para el diseño de una vacuna oral de candidato para la diabetes autoinmune. La proteína diana para este experimento era una forma mutada de la humana 65 kDa glutamato descarboxilasa, que producción y funcionalidad son fácilmente detectables y medibles¹². Su expresión en los tejidos de plantas comestibles fue mediada por los vectores⁵, que mediar un alto nivel de producción de proteínas recombinantes en un marco de tiempo…

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	–	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	–	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	–	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	–	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	–	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	–	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	–	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	–	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	–
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade