Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar
Summary
Detta arbete presenterar ett protokoll för upprättande av en cell SUS pension kultur som härrör från te (Camellia sinensis L.) blad som kan användas för att studera metabolismen av externa föreningar som kan tas upp av hela växten, såsom insekticider.
Abstract
En plattform för att studera insekticid metabolism med hjälp av in vitro-vävnader av teplantan utvecklades. Blad från sterila te plantlets induceras för att bilda lös förhårdnader på murashige och Skoog (MS) basal media med växthormoner 2, 4-diklorfenoxiättiksyra (2, 4-D, 1,0 mg l-1) och kinetin (kt, 0,1 mg l-1). Callus bildades efter 3 eller 4 omgångar av subculturing, varje varar 28 dagar. Lös Valk (ca 3 g) inokulerades sedan till B5 flytande media som innehöll samma växthormoner och odlades i en skakinkubator (120 rpm) i mörker vid 25 ± 1 ° c. Efter 3 − 4 subkulturer, en cell SUS pension som härrör från teblad fastställdes vid en subkultur ratio mellan 1:1 och 1:2 (SUS pension moder vätska: färskt medium). Med hjälp av denna plattform, sex insekticider (5 μg mL-1 varje thiamethoxam, imidakloprid, acetamiprid, imidaklothiz, dimetoat, och omethoate) lades till Tea Leaf-derived cell SUS pension kultur. Metabolismen av insekticider spåras med hjälp av vätskekromatografi och gaskromatografi. För att validera nyttan av te cell SUS pension kultur, metaboliterna av tiamethoxan och dimetoat närvarande i behandlade cell kulturer och intakt växter jämfördes med hjälp av masspektrometri. I behandlade te cell kulturer hittades sju metaboliter av tiamethoxan och två metaboliter av dimetoat, medan de i behandlade intakta växter endast fann två metaboliter av tiamethoxam och en av dimetoat. Användningen av en cell SUS pension förenklat metabolisk analys jämfört med användning av intakt te växter, särskilt för en svår matris som te.
Introduction
Te är en av de mest konsumerade alkoholfria dryckerna i världen1,2. Te framställs av löv och knoppar av Woody perenna Camellia sinensis L. te plantor odlas i stora plantager och är mottagliga för många skade insekter3,4. Organophosphorus och neonikotinoid insekticider används ofta som systemiska insekticider5 för att skydda te plantor från skade djur som Whiteflies, Leaf Hoppers, och vissa fjärilsarter arter6,7. Efter applicering absorberas dessa insekticider eller translokaliseras till växten. Inom anläggningen kan dessa systemiska insekticider omvandlas genom hydrolys, oxidation eller Reduktions reaktioner av växtenzymer. Dessa omvandlings produkter kan vara mer polära och mindre giftiga än moder föreningarna. Men för vissa organofosater är bioaktiviteterna hos vissa produkter högre. Till exempel, acefat metaboliseras till den mer giftiga metamidofos8,9, och dimetoat till ometoat10,11. Växt metaboliska studier är därför viktiga för att bestämma ödet för ett bekämpnings medel inom en anläggning12.
Växt vävnads kulturer har visat sig vara en användbar plattform för undersökning av pesticider metabolism, med de identifierade metaboliterna liknar dem som finns i intakt växter13,14,15. Användningen av vävnads kulturer, särskilt cell SUS pensions kulturer, har flera fördelar. För det första kan experiment utföras fritt från mikroorganismer och på så sätt undvika inblandning av omvandling av bekämpnings medel eller nedbrytning av mikrober. För det andra, vävnads kulturen ger konsekvent material för användning när som helst. För det tredje, metaboliterna är lättare att extrahera från vävnads kulturer än från intakt växter, och vävnads kulturer har ofta färre interring föreningar och lägre komplexitet föreningar. Slutligen kan vävnads kulturer lättare användas för att jämföra en rad bekämpnings medels metabolism i ett enda experiment16.
I denna studie, en cell SUS pension härrör från bladen av steril-odlade te plantlet var framgångs rikt etablerat. Te cell SUS pensionen kulturen användes sedan för att jämföra skingrande beteenden av sex systemiska insekticider.
Detta detaljerade protokoll är avsett att ge viss vägledning så att forskarna kan etablera en växt vävnad kultur plattform användbar för att studera den metaboliska öde xenobiotika i te.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna artikel presenterar den detaljerade processen för att fastställa en modell av pesticider metabolism i te växt vävnad, inklusive val av explants, bestämning av cellernas livs kraft, och inrättandet av en te cell SUS pension kultur med hög metabolisk Aktivitet. Alla delar av en växt vävnad kan användas för att initiera förhårdnader i en steriliserad miljö25. Teblad valdes för förhårdnader initiering i denna studie, inte bara för att bladen tenderar att vara mindre förorenade…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den nationella centrala forsknings & utvecklingsprogram (2016YFD0200900) i Kina, Kinas nationella naturvetenskaplig grund (nr 31772076 och nr 31270728), Kina post doktor Science Foundation (2018M630700), och öppna fonden för Statliga viktiga laboratoriet för Tea Plant biologi och utnyttjande (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O’Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
