دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك
Summary
هذا العمل يقدم بروتوكولا لإنشاء ثقافة تعليق الخلية المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) الأوراق التي يمكن استخدامها لدراسة عملية التمثيل الغذائي للمركبات الخارجية التي يمكن تناولها من قبل النبات كله، مثل المبيدات الحشرية.
Abstract
تم تطوير منصة لدراسة الأيض المبيدات الحشرية باستخدام الأنسجة في المختبر من مصنع الشاي. وقد تم حث أوراق من النباتات الشاي المعقم لتشكيل كالوس فضفاضة على Murashige وSkoog (MS) وسائل الإعلام القاعدية مع الهرمونات النباتية 2،4-ثنائي كلوروفينوكسي حمض (2،4-D، 1.0 ملغ L-1)والكينتين (KT، 0.1 ملغ L-1). شكلت كلوس بعد 3 أو 4 جولات من subculturing، كل 28 يوما. ثم تم تلقيح الكلوس الفضفاض (حوالي 3 غرام) في وسائل الإعلام السائلة B5 التي تحتوي على نفس الهرمونات النباتية وكان مثقفا في حاضنة تهز (120 دورة في الدقيقة) في الظلام في 25 ± 1 درجة مئوية. بعد 3-4 الثقافات الفرعية، تم تأسيس تعليق الخلية المستمدة من ورقة الشاي في نسبة ثقافة فرعية تتراوح بين 1:1 و 1:2 (تعليق السائل الأم: المتوسطة الطازجة). باستخدام هذه المنصة، تم إضافة ستة مبيدات حشرية (5 ميكروغرام مل-1 كل ثياميثوكسام، إيميداكلوبريد، أسيتامبريد، إيميداكلوتيز، ديميثات، وأوميثوت) إلى ثقافة تعليق الخلايا المشتقة من أوراق الشاي. وقد تم تتبع عملية التمثيل الغذائي للمبيدات الحشرية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة وكروماتوغرافيا الغاز. للتحقق من فائدة ثقافة تعليق خلية الشاي، تمت مقارنة المستقلبات من الثياميثوكسان وdimethoate الموجودة في الثقافات الخلايا المعالجة والنباتات سليمة باستخدام الطيف الكتلي. في الثقافات خلية الشاي المعالجة, تم العثور على سبعة المستقلبات من الثياميثوكسان واثنين من الأيض من dimethoate, بينما في النباتات السليمة المعالجة, تم العثور على اثنين فقط من الأيض من الثياميثوكسام واحد من dimethoate. استخدام تعليق الخلية تبسيط التحليل الأيضي مقارنة مع استخدام نباتات الشاي سليمة، وخاصة بالنسبة لمصفوفة صعبة مثل الشاي.
Introduction
الشاي هو واحد من المشروبات غير الكحولية الأكثر استهلاكا على نطاق واسع في العالم1،2. يتم إنتاج الشاي من أوراق وبراعم الكاميليا الخشبية المعمرة سينينسيس L. تزرع نباتات الشاي في مزارع واسعة وهي عرضة للعديد من الآفات الحشرية3،4. وغالبا ما تستخدم المبيدات الحشرية العضوية وneonicotinoid كمبيد حشري نظامي5 لحماية نباتات الشاي من الآفات مثل الذباب الأبيض، النطاط ورقة، وبعض أنواع lepidopteran6،7. بعد الاستخدام، يتم امتصاص هذه المبيدات الحشرية أو نقلها إلى النبات. داخل النبات، يمكن أن تتحول هذه المبيدات الحشرية النظامية من خلال التحلل المائي، والأكسدة أو التفاعلات الحد من قبل الإنزيمات النباتية. هذه المنتجات التحول يمكن أن تكون أكثر القطبية وأقل سمية من المركبات الأم. ومع ذلك، بالنسبة لبعض الفوسفات العضوي، والأنشطة الحيوية لبعض المنتجات أعلى. على سبيل المثال، يتم استقلاب الاسباهياتفي الميثاميدوفوس الأكثر سمية 8،9،وdimethoate في omethoate10،11. دراسات الأيض النباتية هي بالتالي مهمة لتحديد مصير مبيد الآفات داخل مصنع12.
وقد ثبت أن نباتات الأنسجة النباتية منصة مفيدة للتحقيق في عملية التمثيل الغذائي لمبيدات الآفات، مع الأيض المحددة مماثلة لتلك الموجودة في النباتات سليمة13،14،15. استخدام الأنسجة الثقافات، ولا سيما الخلايا مع لتعليق الثقافات، له العديد من المزايا. أولا، يمكن إجراء التجارب خالية من الكائنات الحية الدقيقة، وبالتالي تجنب تدخل تحويل مبيدات الآفات أو تدهورها من قبل الميكروبات. ثانيا، توفر زراعة الأنسجة مواد متسقة للاستخدام في أي وقت. ثالثا، الأيض هي أسهل لاستخراج من ثقافات الأنسجة من النباتات سليمة، وثقافات الأنسجة غالبا ما يكون أقل المركبات المتشابكة وتعقيد أقل من المركبات. وأخيرا، يمكن استخدام ثقافات الأنسجة بسهولة أكبر لمقارنة سلسلة من الأيض مبيدات الآفات في تجربة واحدة16.
في هذه الدراسة، تم بنجاح إنشاء تعليق الخلية المستمدة من أوراق نبات الشاي المعقم. ثم استخدمت ثقافة تعليق خلية الشاي لمقارنة سلوكيات تبديد ستة مبيدات حشرية نظامية.
ويهدف هذا البروتوكول المفصل لتوفير بعض الإرشادات بحيث يمكن للباحثين إنشاء منصة زراعة الأنسجة النباتية مفيدة لدراسة مصير الأيض من xenobiotics في الشاي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعرض هذا المقال عملية مفصلة لإنشاء نموذج من الأيض المبيدات في الأنسجة النباتية الشاي، بما في ذلك اختيار explants، وتحديد بقاء الخلية، وإنشاء ثقافة تعليق خلية الشاي مع ارتفاع التمثيل الغذائي النشاط. ويمكن استخدام أي أجزاء من الأنسجة النباتية لبدء كالوس في بيئة معقمة25. وقد تم اختي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحوث والتطوير الرئيسي (2016YFD02009000) للصين، والمؤسسة العلمية الطبيعية الوطنية في الصين (رقم 31772076 ورقم 31270728)، والمؤسسة الصينية للعلوم ما بعد الدكتوراه (2018M630700)، والصندوق المفتوح للعلوم مختبر الدولة الرئيسية لبيولوجيا مصنع الشاي واستخدامها (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O’Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
