Verstrekken van eencellige gevoeligheid, is real-time stroom cytometry uniek geschikt voor het kwantificeren van multimodale receptor functies van levende culturen. Met behulp van neurale volwassen voorlopercellen, de P2X7 receptor functie evalueerden via calcium toestroom gedetecteerd door calcium indicator kleurstof, transmembraan porie vorming door ethidium bromide opname en fagocytose met behulp van fluorescerende latex kralen.
Live-cel stroom cytometry wordt steeds gebruikt onder biologen van de cel te kwantificeren van de biologische processen in een levende cel cultuur. Dit protocol beschrijft een methode waarbij live-cel stroom cytometry wordt uitgebreid op de veelvoudige functies van de P2X7 receptor activering in realtime analyseren. Met behulp van een module van de tijd op een stroom cytometer geïnstalleerd, kan live-cel functionaliteit worden beoordeeld en uitgezet gedurende een bepaalde periode te verkennen de kinetiek van calcium toestroom, transmembraan porie vorming en fagocytose. Deze eenvoudige methode is gunstig als alle drie canonieke functies van de P2X7 receptor kunnen worden beoordeeld met behulp van één machine, en de verzamelde gegevens die zijn uitgezet in de tijd informatie over de gehele bevolking van de live-cel in plaats van eencellige opnames vaak geeft met behulp van de technisch uitdagende patch-clamp methoden verkregen. Calcium toestroom experimenten een calcium indicator kleurstof gebruiken, terwijl P2X7 porie vorming assays afhankelijk van ethidiumbromide wordt mag worden doorgelaten door de transmembrane porie gevormde op hoge agonist concentraties. Geel-groen (YG) latex parels worden gebruikt voor het meten van fagocytose. Specifieke agonisten en antagonisten worden toegepast om de onderzoeken van de effecten van de P2X7 receptor activiteit. Deze methoden kunnen individueel, worden gewijzigd om kwantitatieve gegevens op elk gewenst aantal calcium kanalen en purinergic en scavenger receptoren. Samen genomen, benadrukken ze hoe het gebruik van real-time live-cel stroom cytometry is een snelle, rendabele, reproduceerbare en kwantificeerbare methode te onderzoeken P2X7 receptor functie.
De studie van purinergic signalering is breed en veelzijdig, waarbij cellulaire fysiologie, biochemie en farmacologie. Purinergic signalering is betrokken bij een oneindig aantal cellulaire en moleculaire processen, door kanker en celcyclus verordening cel-cel communicatie en stamcelbiologie; Zo bestaat er vaak een potentieel te moduleren purinergic signalering voor een therapeutisch nut hebben. Van de purinergic-receptoren, heeft de P2X7 receptor aanzienlijke aandacht gekregen in de afgelopen jaren als gevolg van haar potentieel als een therapeutisch doel voor talrijke inflammatoire voorwaarden1. Methoden voor het bestuderen van de receptor hebben ontwikkeld en aangepast jaren om dit onderzoek2,3,4,5. Hier beschrijven we een live-cel stroom cytometry methode om te onderzoeken van de veelvoudige functies van P2X7 receptoren in volwassen neurale voorlopercellen, afgeleid van de subventriculaire zone (SVZ) en de hippocampal getand gyrus.
De P2X7 receptor werd voor het eerst beschreven als de P2Z receptor, of de ‘de dood van de cel’-receptor, als de activering met hoge concentraties van adenosine trifosfaat (ATP) resulteert in de vorming van een grote transmembraan porie luchtdoorlatend moleculen tot 900 Da6. Dit leidt tot de omlegging van het cytoskeletal, transmembraan porie vorming en, potentieel, apoptosis en/of necrose7. Traditioneel, is deze functie van P2X7 wordt gekwantificeerd door de opname van grote molecuulgewicht kleurstoffen zoals YO-PRO-1 of ethidium bromide (en), die lichten wanneer tussenliggende met DNA3,8. Plaat lezer methoden, die snelle en toestaan voor upscaling, over het algemeen toegestaan niet voor de waarneming van kinetiek. De hier beschreven methode is gebaseerd op ethidium opname en kan de verhoging van fluorescentie in acht worden genomen na verloop van tijd bieden een grotere diepte van informatie met betrekking tot de snelheid van de vorming van de porie. P2X7 receptoren zijn sindsdien gebleken om een aantal nonimmune functies, met verschillende reacties afhankelijk van blootstelling tijd en agonist concentratie9,10. Korte activering door lagere concentraties van ATP resultaten in catie toestroom ten behoeve van de neurotransmitter en signaal transductie11. Met behulp van cytometry van de stroom te meten van calcium toestroom overwint de problemen in verband met omslachtig en technisch uitdagende methoden — met name patch klemmen voor het meten van inkomende stromen die onschatbare nadere bijzonderheden over de wijziging van potentieel over te geven een celmembraan maar laat niet voor bevolking analyse2. De derde functie van P2X7 receptoren treedt op in de afwezigheid van ATP, waar P2X7 receptoren hebben aangetoond dat fagocytose in zowel het immuunsysteem en het zenuwstelsel9,12,13te vergemakkelijken. Vooruitgang in de microscopie technieken hebben toegestaan de visualisatie van cytoskeletal herschikkingen tijdens de opname, hoewel kwantificering en bevolking analyse kan nog steeds een uitdaging voorleggen.
De live-cel stroom cytometry methode gedetailleerde hier zorgt voor het onderzoek van alle drie belangrijkste functies van P2X7 receptoren in real-time. De opname van een tijd module apparaat op de stroom cytometer kan temperatuurcontrole en voortdurend roeren van cellen in suspensie. Agonist en antagonist stimuli kunnen geleverd worden binnen een seconde, waardoor de in de omgeving van ononderbroken meting van de cellulaire respons. Dit biedt een snelle en eenvoudige methode om te kwantificeren reproducibly functie terwijl het vermijden van het gebruik van meerdere assay systemen. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk celtype en kan worden gebruikt om andere subtypen van de receptor gezien de opneming van specifieke agonisten of remmers, afhankelijk van hun eigenschappen onderzoeken.
Dit document stelt een gedetailleerd protocol voor de analyse van de P2X7 receptor functie in neurale voorlopercellen celculturen afgeleid van de volwassen neurogene niches. De mogelijke toepassingen voor volwassen neurale progenitor cells variëren van onderzoek voor therapeutische doeleinden, en dus de methode van cultuur moet robuust en reproduceerbaar. Er zijn een aantal belangrijke aspecten bij dit protocol die mogelijk van invloed op de kwaliteit van de cultuur van het eindpunt. Zodra van de schedel verwijderd, de hersenen mogen niet te drogen en de dissectie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Met name met de hippocampus, zal extra zorgvuldigheid alle bloedvaten of membraanachtig weefsel te verwijderen resulteren in superieure progenitor cel opbrengsten. Het proces van dissociatie en verpulvering kan sterk invloed hebben op het aantal bollen verkregen in een cultuur; schudden van het weefsel tijdens de incubatie met trypsine-EDTA zal resulteren in een meer homogene oplossing. Het gebruik van een brand-gepolijst glas pasture pipet over een P1000 plastic pipet tip wordt sterk aanbevolen om het verminderen van de dood van de cel en de resulterende cultuur te verbeteren. Vermijd overtriturating. Ondanks deze voorzorgsmaatregelen de procedure een heleboel puin kunt maken in de P0-cultuur, en om te voorkomen dat verliezen van voorlopercellen, wassen of voeding van de cultuur moeten worden vermeden tot bollen hebben gevormd.
Een aantal verschillen tussen de hippocampal en SVZ culturen duidelijk op P0 zullen worden. Hippocampal culturen opbrengst minder bollen, en dit over het algemeen houden. Hiermee kunt u dat een uiteinde van de pipet zachtjes til van de bollen voor de eerste passage. Aanhangend sferen werden niet vastgesteld bij volgende passages. Verschillende merken van weefselkweek kolven kan de bollen, met name hippocampal bollen, te houden en te groeien als kolonies op de bodem van de schotel. Dit bleek niet te wijzigen geen downstream resultaten voor dit protocol maar moet worden gecontroleerd, en consistentie moet worden gehandhaafd indien mogelijk.
Vorige methoden gebruikt voor het meten van de P2X7 receptor functie, zoals patch klemmen om op te nemen van calcium toestroom, zijn tijdrovend en moeizaam en kunnen alleen informatie verschaffen over een enkele cel. Dit protocol biedt een snelle en reproduceerbare methode voor het analyseren van alle drie hoofdfuncties van P2X7 receptoren met behulp van één machine. Time-resolved live-cel stroom cytometry zorgt voor analyse van de hele bevolking en geeft informatie over de kinetiek van calcium toestroom, porie vorming en/of fagocytische functie de onderzoeker. Naast dit, kan stroom cytometry gemakkelijk worden gebruikt als een methode voor de beoordeling van de marker-expressiepatronen en analyse van de bevolking op basis van de cel grootte of eiwit expressie niveaus.
Bij het uitvoeren van deze experimenten, kunnen verschillen in maximale calcium toestroom, ethidium opname of fagocytose tarieven tussen herhalingen worden waargenomen. Om te minimaliseren dit, de grootte van het gebied, worden kweekomstandigheden en voeding regime moet consistent, zoals de gezondheid van de cellen een aanzienlijke invloed op de resultaten hebben zal. De tijd op het ijs kan ook invloed hebben op de gegevens, dus zorgen alles tevoren is voorbereid, zodat de tijd op ijs minimaal is. Erop toe dat de calcium indicator kleurstof laadtijd aansluit. Een andere factor die tot grote inconsistenties in de maximale calcium opnamen leiden kan is de variatie tussen ATP batches. De voorbereiding van ATP voorraden is cruciaal, en het gebruik van verschillende batches instellen voor de dezelfde experimenten moet worden vermeden. Vergelijking van oude en nieuwe partijen om ervoor te zorgen dat het ATP strookt wordt ook aangeraden. De effectiviteit van P2X7 antagonisten kan ook zo cel-lijn – en batch-afhankelijk, optimalisatie van incubatie tijden en concentraties kan worden verlangd.
Het is vermeldenswaard dat calcium toestroom/efflux is een van de meest fundamentele en complexe cellulaire functies en kan worden bemiddeld door veel receptoren. De toestroom van de ATP-geïnduceerde calcium, zoals een klassieke meting voor P2X7 kanaal/porie functie, kan niet nauwkeurig overeen met de functie waar van P2X7-receptoren, als ATP kan ook activeren P2Y receptoren vrijgeven van intracellulair calcium. In dit geval, wellicht barium een betere catie te gebruiken in plaats van calcium als de instroom unidirectioneel16 is. Zodat u kunt onderscheiden van de bijdrage van P2Y receptoren in calcium toestroom, mogen waar 1 mM EDTA of ethyleenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) wordt toegevoegd aan het medium K+ in plaats van CaCl2 voorwaarden worden gebruikt in dit assay.
Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast om aan te passen andere celtypes en kan nuttig zijn voor het onderzoeken van de functionaliteit van alternatieve ion kanaal receptoren of receptoren die deel van fagocytose uitmaken. Deze methode kan ook worden aangepast aan een stroom cytometry machine zonder een tijd-module. Als voorbeeld kunnen fagocytose testen worden uitgevoerd waar YG kralen 7 – 8 min vóór de analyse door conventionele stroom cytometry worden toegevoegd. Houden van de cellen bij 37 ° C en continu swirl hen. Dit zal niet het bieden van real-time informatie maar verschillen in de gemiddelde laatste fluorescentie zal nog steeds de onderzoeker met betrekking tot de functionaliteit van P2X7-receptoren in kennis.
Belangstelling voor P2X7 receptoren als een drug target21,22 of zelfs als een drug delivery route23,24 groeit snel, en dus methoden om te studeren van deze raadselachtige receptor moet voortdurend aangepast en verbeterd om te deze studies te vergemakkelijken. Dit protocol beschrijft methodologieën die kunnen worden gebruikt voor het verkennen van de P2X7 functie in volwassen neurale voorlopercellen, en gehoopt wordt dat de verwezenlijking van een beter begrip van P2X7-receptoren in de neurogene nissen tot vooruitgang in de behandeling van een beroerte leiden kan en andere ischemische verwondingen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil Maria Kasherman en Xin Huang bedanken voor hun bijdragen aan dit onderzoek. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation te M.W., T.C.L., M.L., en T.C.L. van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) van Australië (571100 en 1048082) en de Baxter Charitable Foundation ( Sydney, Australië). B.G. werd gesteund door de Australian Research Raad (ARC) toekomst Fellowship (FT120100581), NHMRC Project Grants (1048082, 1061419 en 1120095) en de Victoriaanse regering operationele infrastructuur ondersteuning subsidie aan het Instituut Florey. M.L. werd gesteund door een Charles D. Kelman, M.D. postdoctorale Award (2010) van de internationale Retinal Research Foundation (USA).
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |