Gir encellede følsomhet, er sanntid flowcytometri unikt tilpasset å kvantifisere flere reseptor funksjoner av levende kulturer. Bruker voksen nevrale stamceller, ble funksjonen P2X7 reseptor vurdert via kalsium tilstrømningen oppdaget av kalsium indikator dye, transmembrane pore dannelsen av ethidium bromide opptak og fagocytose bruker fluorescerende latex perler.
Live-celle flowcytometri er vanligere blant celle biologer for å kvantifisere biologiske prosesser i en levende celle kultur. Denne protokollen beskriver en metode der live-celle flowcytometri utvides ved for å analysere flere funksjoner P2X7 reseptor aktivisering i sanntid. Bruker en tid-modul installert på en flyt cytometer, kan live-celle funksjonalitet vurderes og tegnes over en gitt tidsperiode å utforske the kinetics av kalsium tilstrømningen, transmembrane pore dannelse og fagocytose. Denne enkle metoden er fordelaktig som alle tre kanoniske funksjonene til P2X7 reseptoren kan vurderes ved hjelp av en maskin, og samlet data tegnes over tid gir informasjon om hele live-celle befolkningen i stedet for én celle opptak ofte får teknisk utfordrende patch-klemme metoder. Kalsium tilstrømningen eksperimenter bruk en kalsium indikator fargestoff, mens P2X7 pore formasjon analyser stole på ethidium bromide lov til å passere gjennom den transmembrane pore dannet på høy Agonistiske konsentrasjoner. Gul-grønn (YG) latex perler benyttes for å måle fagocytose. Bestemt agonister og antagonister brukes for å undersøke effekten av P2X7 receptor aktivitet. Individuelt, kan disse metodene endres for å gi kvantitative data på en rekke kalsium kanaler og purinergic og åtseldyr reseptorer. Sammen markere de hvor bruken av sanntids live-celle flowcytometri er en rask, kostnadseffektiv, reproduserbare og kvantifiserbare metode for å undersøke P2X7 reseptor-funksjonen.
Studiet av purinergic signalering er bred og mangesidig, som involverer mobilnettet fysiologi, biokjemi og farmakologi. Purinergic signalering er involvert i en uendelig rekke av mobilnettet og molekylære prosesser, fra kreft og celle syklus regulering til celle-celle communications og stamcelleforskningen biologi; som sådan, finnes det ofte et potensial til å modulere purinergic Signaliser for en terapeutisk fordel. Av purinergic reseptorer, har P2X7 reseptor fått betydelig oppmerksomhet de siste årene på grunn av dens potensial som et terapeutisk mål for mange inflammatoriske tilstander1. Metoder for å studere reseptoren har utviklet og tilrettelagt gjennom årene for å lette denne forskning2,3,4,5. Her beskriver vi en live-celle flyt cytometri metode for å undersøke flere funksjoner P2X7 reseptorer i voksen nevrale stamceller fra de subventricular sonen (SVZ) og den hippocampus dentate gyrus.
P2X7 reseptoren ble først beskrevet som P2Z reseptoren eller ‘celledød’ reseptoren, som dens aktivisering med høye konsentrasjoner av adenosin trifosfat (ATP) resultater i dannelsen av en stor transmembrane pore permeable til molekyler opptil 900 Da6. Dette fører til cellen cytoskjelett omorganisering, transmembrane pore dannelse, og mulig apoptose og/eller nekrose7. Tradisjonelt, er denne funksjonen av P2X7 kvantifisert av opptaket av store molekylvekt fargestoffer som YO-PRO-1 eller ethidium bromide, som fluoresce når under sommer med DNA3,8. Plate leser metoder, som er rask og tillate oppskalering, vanligvis tillater ikke for observasjon av kinetics. Metoden beskrevet her er basert på ethidium opptaket og lar fluorescens økningen følges over tid, gir en større dybde av informasjon med hensyn til hastigheten pore-formasjonen. P2X7 reseptorer har siden blitt vist å forenkle mange nonimmune funksjoner, med forskjellige svar avhengig av eksponering tid og Agonistiske konsentrasjon9,10. Kort aktivering ved lave konsentrasjoner ATP resulterer i kation tilstrømningen i forbindelse med nevrotransmitter og signal signaltransduksjon11. Bruker flowcytometri til å måle kalsium tilstrømningen overvinner problemene knyttet til tungvint og teknisk utfordrende-spesielt oppdatering clamping for å måle innover strømninger som gi uvurderlig informasjon om endringen i potensial over en celle membran, men tillater ikke for befolkningen analyse2. Den tredje funksjonen av P2X7 reseptorer oppstår i fravær av ATP, der P2X7 reseptorer har vist seg for å lette fagocytose både immunsystemet og nervesystemet9,12,13. Fremskritt i mikroskopi teknikker har tillatt visualisering av cellen cytoskjelett rearrangements under opptak prosessen, selv om kvantifisering og befolkningen kanne fremdeles gave en utfordring.
Live-celle flyt cytometri metoden finnesher gjør etterforskningen av alle tre hovedfunksjoner av P2X7 reseptorer i sanntid. Inkludering av en gang modul enhet på flyt cytometer tillater temperaturkontroll og kontinuerlig omrøring celler i suspensjon. Agonistiske og antagonist stimuli kan leveres innen andre, slik at nær uavbrutt måling av cellulær respons. Dette gir en rask og enkel metode for å kvantifisere reproduserbar funksjonen og unngå bruk av flere analysen systemer. Det er viktig å merke seg at denne protokollen kan lett tilpasses en celle type og kan brukes til å undersøke andre reseptor subtyper gitt inkludering av bestemte agonister eller hemmere, avhengig av deres egenskaper.
Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll for analyse av P2X7 reseptor funksjon i nevrale cellekulturer fra voksen neurogenic nisjene. De potensielle programmene for voksen nevrale celler varierer fra forskning til terapeutiske formål, og så metoden kultur må være robust og reproduserbar. Det finnes en rekke viktige aspekter til denne protokollen som kan påvirke kvaliteten på sluttpunktet kulturen. Når fjernet fra skallen, hjernen bør ikke få lov til å tørke og dissection skal utføres så raskt som mulig. Spesielt med hippocampus medfører ekstra forsiktighet tatt å fjerne blod fartøy eller membranous vev overlegen stamfar celle avkastning. Dissosiasjon og føden prosessen kan påvirke antall kuler innhentet i en kultur; agitating vev under incubation med trypsin-EDTA vil resultere i en mer homogen løsning. Bruk av en brann-polert glass beiter pipette over en P1000 plastikk pipe tips anbefales å redusere celledød og forbedre den resulterende kulturen. Unngå overtriturating. Til tross for disse forholdsreglene, prosedyren kan opprette en masse rusk i P0 kultur, og for å unngå å miste progenitor celler, vask eller fôring kulturen bør unngås til kuler har dannet.
En rekke forskjeller mellom den hippocampus og SVZ kulturer vil bli veldig tydelig på P0. Hippocampus kulturer gir færre kuler, og dette vanligvis følge. Bruke en pipette tips til løft av kulene for første passering. Tilhenger kuler var ikke observert i etterfølgende avsnitt. Forskjellige merker av vev kultur kolber kan forårsake Sfærene, spesielt hippocampus sfærer, følge og vokse som kolonier på bunnen av parabolen. Dette finner ikke for å endre noen nedstrøms resultater for denne protokollen, men bør overvåkes og konsistens bør opprettholdes der det er mulig.
Metodene som brukes til å måle P2X7 reseptor-funksjon, som oppdateringen clamping for å registrere kalsium pågangen, er tidkrevende og arbeidskrevende og kan bare gi informasjon om en enkelt celle. Denne protokollen gir en rask og reproduserbar metode for å analysere alle tre hovedfunksjoner av P2X7 reseptorer ved hjelp av en maskin. Tid-løst live-celle-flowcytometri gir hele befolkningen analyse og gir forskeren informasjon om kinetics av kalsium tilstrømningen, pore formasjon eller phagocytic funksjon. I tillegg kan flowcytometri lett brukes for å vurdere markør uttrykk mønstre og befolkningen analyse basert på celle størrelsen eller protein uttrykk.
Når du utfører disse eksperimentene, observeres forskjeller i maksimal kalsium tilstrømningen, ethidium opptak eller fagocytose priser mellom gjentakelser. For å minimere dette kule størrelsen, må oppdrettsforholdene og fôring regimet være konsekvent som helse cellene vil ha en betydelig innvirkning på resultatene. Tiden på isen kan også påvirke dataene, så sikre alt er forberedt på forhånd slik at tiden på isen er minimal. Kontroller at kalsium indikator fargestoff lastetiden er konsekvent. En annen faktor som kan føre til store inkonsekvenser i maksimal kalsium opptakene er variasjon mellom ATP bunker. Utarbeidelse av ATP aksjer er avgjørende, og bruk av forskjellige bunker for samme eksperimenter bør unngås. Sammenligne gamle og nye grupper for å sikre ATP er konsekvent anbefales også. Effektiviteten av P2X7 antagonister kan også være cellen linje – og batch-avhengige, slik optimalisering av inkubasjon ganger og konsentrasjoner kan være nødvendig.
Det er verdt å merke seg at kalsium tilstrømningen/middelklasseinnbyggere er en av de mest grunnleggende og komplekse cellulære funksjonene og kan være formidlet av mange reseptorer. ATP-indusert kalsium tilstrømningen, som et klassisk mål for P2X7 kanal/pore-funksjonen, ikke kanskje nøyaktig gjenspeiler den sanne funksjonen P2X7 reseptorer, som ATP kan også aktivere P2Y reseptorer å løslate intracellulær kalsium. I dette tilfellet kan barium være en bedre kasjon skal brukes i stedet for kalsium som sin tilstrømningen enveis16. For å skille bidraget fra P2Y reseptorer i kalsium tilstrømningen, kan betingelser der 1 mM EDTA eller ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tetraacetic syre (EGTA) legges til K+ mediet i stedet for CaCl2 brukes i dette analysen.
Denne protokollen kan også lett tilpasses andre celletyper, og kan være nyttig for å undersøke funksjonaliteten til alternative ion kanal reseptorer eller reseptorer som deltar i fagocytose. Denne metoden kan også tilpasses en flyt cytometri maskin uten en gang modul. Som et eksempel, kan fagocytose analyser utføres der YG perler legges 7 – 8 minutter før analysen av konvensjonelle flowcytometri. Holde cellene på 37 ° C og kontinuerlig virvel dem. Dette gir sanntidsinformasjon men forskjeller i de mener siste fluorescensen fortsatt informere forskeren om funksjonaliteten til P2X7 reseptorer.
Interesse P2X7 reseptorer som et legemiddel mot21,22 eller som en narkotika-leveranser rute23,24 vokser raskt, og så å studere denne gåtefulle reseptoren må være kontinuerlig tilpasset og forbedres til forenkle disse studiene. Denne protokollen skisserer metoder som kan brukes til å utforske P2X7-funksjonen i voksen nevrale stamceller, og håpet er at oppnå en større forståelse av P2X7 reseptorer i neurogenic nisjene kan føre til fremskritt i behandling av hjerneslag og andre iskemiske skader.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Maria Kasherman og Xin Huang for deres bidrag til denne forskningen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra forskningsstiftelse for Rebecca L. Cooper M.W., T.C.L. og M.L. og T.C.L. fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia (571100 og 1048082) og Baxter Charitable Foundation ( Sydney, Australia). BG ble støttet av australske Research Council (ARC) fremtid fellesskap (FT120100581) NHMRC prosjekt stipend (1048082, 1061419 og 1120095) og den viktorianske regjeringen operative infrastruktur støtte Grant til Florey Institute. M.L. ble støttet av en Charles D. Kelman, MD postdoktor Award (2010) fra International Retinal Research Foundation (USA).
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |