Purification et la Transplantation de cellules progéniteurs myogéniques dérivé Exosomes afin d’améliorer la fonction cardiaque chez les souris dystrophiques musculaires de Duchenne
Summary
Nous présentons ici un protocole pour améliorer transitoirement la fonction cardiaque chez les souris de dystrophie musculaire de Duchenne en transplantant des exosomes dérivée de cellules progénitrices myogéniques normal.
Abstract
Duchene de Duchenne (DMD) est une maladie génétique récessive liée à le X causée par un manque de protéine dystrophine fonctionnelle. La maladie ne peut pas être guérie, et que la maladie progresse, le patient développe des symptômes d’insuffisance cardiaque congestive, arythmie et une cardiomyopathie dilatée. Les souris mutantes DMDMDX n’expriment pas la dystrophine et sont couramment utilisés comme un modèle murin de DMD. Dans notre étude récente, nous avons observé que l’injection intramyocardique de type large (WT)-exosomes de dérivés de cellules progéniteurs myogéniques (MPC-Exo) restauré transitoirement l’expression de la dystrophine dans le myocarde de souris mutantes DMDMDX , qui a été associé avec une amélioration transitoire en suggérant que la fonction cardiaque WT-MPC-Exo peut fournir une option pour soulager les symptômes cardiaques de DMD. Cet article décrit la technique de purification MPC-Exo et la transplantation dans les cœurs des souris mutantes DMDMDX .
Introduction
Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une lié à le X récessive, progressive maladie neuromusculaire due à une mutation dans le gène DMD et la perte de la dystrophine fonctionnelle1. La dystrophine est exprimée principalement dans le myocarde et le muscle squelettique et est moins exprimée dans le muscle lisse, les glandes endocrines et les neurones2,3. DMD est le type le plus commun de la dystrophie musculaire avec une fréquence d’un par 3 500 à 5 000 garçons nouveau-nés dans le monde entier4,5. Individus développent généralement une nécrose musculaire progressive, perte de la marche indépendante de début de l’adolescence et la mort dans les décennies de deuxième et troisième de leur vie en raison de l’insuffisance cardiaque et insuffisance respiratoire6.
Cardiomyopathie dilatée, arythmies et insuffisance cardiaque congestive sont des manifestations cardiovasculaires courantes de DMD7,8. La maladie ne peut pas être guérie, un traitement de soutien peut améliorer les symptômes ou retarder la progression de l’insuffisance cardiaque, mais il est très difficile d’améliorer le cœur fonction9,10.
Similaires aux patients DMD, la dystrophie musculaire liée à le X (MDX) souris sont déficientes en protéine dystrophine et les symptômes présents de cardiomyopathie11et sont donc largement utilisés dans la recherche de cardiomyopathie DMD associé. Afin de rétablir la dystrophine dans les muscles affectés, la thérapie de cellules souches allogéniques s’est avéré pour être un traitement efficace pour la DMD12,13,14. Exosomes, vésicules de membrane de 30-150 nm sécrétées par divers types de cellules, jouent un rôle clé dans la communication de cellule-cellule par l’intermédiaire de transport de matériel génétique, telles que l’ARN messager (ARNm) et non-codantes RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nos études antérieures ont montré qu’exosomes dérivé de progéniteurs myogéniques (MPC), tels que la lignée C2C12, peut transférer la dystrophine ARNm d’hôte cardiomyocytes après injection cardiaque directe22, indiquant que la livraison allogénique de Les exosomes dérivé de MPC (MPC-Exo) peut restaurer transitoirement l’expression des gènes chez les souris MDX DMD. Cet article se concentre sur les techniques de purification et de la transplantation MPC-Exo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode consistant à isoler les exosomes pure est essentielle pour l’étude de la fonction des exosomes. Une des techniques communes pour l’isolement de l’exosome est polyéthylène glycols (PEG) médiée par précipitation17,18,25. Exosomes peut être précipité dans les chevilles et granulés par centrifugation à basse vitesse. PEG-mediated purification est très pratique et peu coûteux, il n’a pas besoin des ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang ont été partiellement pris en charge par l’American Heart Association : NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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