쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제
Summary
이 프로토콜은 마이크로RNA 기반 억제제 치료를 테스트하는 플랫폼으로서 인간 갑상선 종양발생의 이종이식 및 정형외 마우스 모델을 설명합니다. 이 접근법은 비코딩 RNA의 기능과 새로운 치료 표적으로서그들의 잠재력을 연구하는 데 이상적입니다.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs)는 mRNA를 불안정하게 하고 표적 mRNA의 번역을 억제하는 그들의 기능을 통해 유전자 발현의 중요한 레귤레이터입니다. 점점 더 많은 연구가 miRNAs를 암 진단 및 예후를 위한 잠재적인 바이오마커로, 또한 치료 표적으로 확인하여 암 평가 및 치료에 추가 차원을 추가했습니다. 갑상선암의 맥락에서, 종양 발생은 중요한 유전자의 돌연변이뿐만 아니라 많은 miRNAs의 과발현에서 발생합니다. 따라서, 갑상선 유전자 발현의 조절에서 miRNA의 역할은 암에서 중요한 기전으로서 진화하고 있다. 본 명세서에서, 우리는 인간 종양 이종이식 및 직교 마우스 모델을 사용하여 갑상선암에서 치료 적 양상으로서 miRNA 억제제 전달의 효과를 검사하는 프로토콜을 제시한다. GFP와 luciferase를 발현하는 안정된 갑상선 종양 세포를 공학한 후에, 세포는 종양을 개발하기 위하여 누드 마우스로 주입되고, 생물 발광에 선행될 수 있습니다. miRNA의 생체 내 억제는 종양 성장을 감소시키고 miRNA 유전자 표적을 업조절할 수 있다. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 것 외에도 생체 내에서 결정된 miRNA의 중요성을 평가하는 데 사용될 수 있다.
Introduction
갑상선암은 부각이 증가하는 내분비 악성종양이지만, 일반적으로 좋은결과를 가지고 있지만 1. 그럼에도 불구하고 일부 환자는 치료할 수없는 질병의 공격적인 형태를 개발하고 분자 기지는 제대로 이해되지않습니다2.
miRNA는 많은 조직에서 유전자 발현을 조절하는 22-뉴클레오티드-긴 비코딩 RNA이며, 일반적으로 표적 메신저 RNA(mRNA)의 3′ 비번역 영역(3’UTR)에 염기 쌍 결합에 의해 mRNA 분해 또는 번역 억압을 유발합니다. 3개 , 4.마이크로RNA 발현의 규제 완화가 암의 특징임을 보여주는 증거가 증가하고 있는데, 이러한 분자는 증식 신호, 이동, 침입 및 전이를 조절하고 세포 사멸에 대한 저항성을 제공할 수 있습니다. 5,6. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 암 진단 및 예후뿐만 아니라 치료 대상7에대한 잠재적 인 바이오 마커로 miRNAs를 확인, 암 평가 및 치료에 새로운 차원을 제공.
miRNAs는 인간 갑상선 종양학의 핵심 동인으로 인간 분자 종양학의 중심 무대를 취했습니다 8,9,10,11,12. miRNAs 상이 조절 중, miR-146b는 유두 갑상선 암종 (PTC) 종양에서 높게 발현되고 세포 증식을 현저하게 증가시키고, 공격성과 음침한 예후와 연관되는 것으로 나타났다6, 12세 , 13세 , 14세 , 또한,miR-146b는 분화12에관여하는 여러 갑상선 유전자를 조절하고, 또한 PTEN16 및 DICER117과같은 중요한 종양 억제 유전자를 조절한다. 암 생물학에 있는 그들의 중요성에도 불구하고, miRNA 기지를 둔 암 치료는 아직 초기 단계에 있고, 아주 몇몇 연구 결과는 갑상선암을 해결했습니다 – 내분비 종양의 가장 빈번한18. 여기서 우리는 인간 유래 종양을 가진 2개의 상이한 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 기술하며, 여기서 세포 miRNA를 특이적으로 억제하는 합성 miRNA 억제제(antagomiR)를 투여하면 종양 성장을 차단할 수 있다. 먼저 일반적인 이종이식 모델을 사용하였고, 안아고미R의 국소 종양 투여는 종양 발광의 감소로측정된 종양 성장 감소(16). 인간 종양 진행을 모방한 견고한 마우스 모델의 확립은 독특한 치료 접근법을 개발하는 데 필수적이기 때문에, 원발성 인간 종양의 정형화 이식은 신약의 임상 적 검증을 위한 보다 더 가치 있는 플랫폼입니다. 피하 이식 모델. 따라서, 안아고미R의 치료 잠재력을 더 잘 평가하기 위해, 우리는 혈류에서 전신 전달을 가진 직교 마우스 모델을 사용하여 동일한 결과를 얻었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 종양 개시 및 진행에 대한 그것의 역할, 갑상선암의 치료 표적으로서의 잠재력을 더 잘 이해하기 위해 miRNA의 생체 내 기능을 연구하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 종양 이종이식 모델은 그들의 생물 발광 신호에 의해 추적될 수 있는 세포의 사용에 기초하며, 치료의 영향하에 생체 내에서 종양 성장의 측정을 허용한다. 또한, 우리는 갑상선 암에 대한 miRNA 기반 치료의 사용을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 라켈 아로차 리스코가 쥐의 치료와 치료에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 박사 J. 블랑코 (사전 화학-CSIC카탈로니아 연구소)와 박사 E. 마토 (인스티투트 드 레세르카 드 l’병원 드 라 산타 크루 i 산트 파우) 바르셀로나 (스페인) CMV-반딧불 luc-IRES-EGFP와 Cal62-Luc 세포를 선물에 대한 각각 감사합니다.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
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