В Vivo ингибирование микроРНК для уменьшения роста опухоли у мышей
Summary
Этот протокол описывает ксенотрансплантат и ортотопические мыши модели опухоли щитовидной железы человека в качестве платформы для тестирования микроРНК основе ингибитор лечения. Этот подход идеально подходит для изучения функции некодирующих РНК и их потенциала в качестве новых терапевтических целей.
Abstract
МикроРНК (миРНК) являются важными регуляторами экспрессии генов через их способность дестабилизировать мРНК и препятствовать переводу целевых мРНК. Постоянно растущее число исследований определили miRNAs в качестве потенциальных биомаркеров для диагностики рака и прогноза, а также в качестве терапевтических целей, добавив дополнительное измерение к оценке рака и лечения. В контексте рака щитовидной железы, опухолевые результаты не только от мутаций в важных генах, но и от переэкспрессии многих miRNAs. Соответственно, роль миРНК в контроле экспрессии генов щитовидной железы развивается как важный механизм при раке. В этом случае мы представляем протокол для изучения последствий доставки ингибитора миРНК в качестве терапевтического модальности при раке щитовидной железы с использованием ксенотрансплантата опухоли человека и ортотопических моделей мыши. После инженерных стабильных опухолевых клеток щитовидной железы, выражающих GFP и люциферазу, клетки вводятся в обнаженных мышей для развития опухолей, которые могут сопровождаться биолюминесценции. Ингибирование in vivo miRNA может уменьшить рост опухоли и upregulate цели гена miRNA. Этот метод может быть использован для оценки важности определяется miRNA in vivo, в дополнение к выявлению новых терапевтических целей.
Introduction
Рак щитовидной железы является эндокринной злокачественности с увеличением заболеваемости, хотя в общих чертах он имеет хороший результат1. Тем не менее, у некоторых пациентов развиваются агрессивные формызаболевания, которые не поддаются лечению, а молекулярные основы плохо изучены 2.
miRNAs являются 22-нуклеотидных РНК, которые регулируют экспрессию генов во многих тканях, как правило, по базовой паре, связывающей с 3′ непереводной области (3’UTR) целевых РНК-мессенджера (mRNAs), вызывая деградацию мРНК или трансляционные репрессии 3 , 4.Существует все больше доказательств того, что дерегулирование экспрессии микроРНК является отличительной чертой рака, так как эти молекулы модулировать пролиферативной сигнализации, миграции, вторжения и метастазирования, и может обеспечить устойчивость к апоптозам 5,6. В последние годы, многие исследования определили miRNAs в качестве потенциальных биомаркеров для диагностики рака и прогноза, а также терапевтические цели7, обеспечивая новое измерение для оценки рака и лечения.
miRNAs заняли центральное место в молекулярной онкологии человека в качестве ключевых факторов неоплазмы щитовидной железычеловека8,9,10,11,12. Среди miRNAs вверх-регулируется, miR-146b сильно overexpressed в Папиллярной щитовидной карциномы (PTC) опухоли и было показано, значительно увеличить пролиферацию клеток, и быть связаны с агрессивностью и мрачный прогноз6, 12 Лет , 13 Год , 14 Год , 15. Кроме того, miR-146b регулирует несколько генов щитовидной железы, участвующих в дифференциации12, а также важные гены супрессоров опухоли, такие как PTEN16 и DICER117. Несмотря на их важность в биологии рака, miRNA основе терапии рака все еще находится на ранних стадиях, и очень немногие исследования были рассмотрены рака щитовидной железы – наиболее частые из эндокринных опухолей18. Здесь мы описываем протокол с использованием двух различных моделей мыши с человеческими опухолями, в которых введение синтетического ингибитора miRNA (antagomiR), который специально подавляет клеточной миРНК может блокировать рост опухоли. Мы впервые использовали общую модель ксенотрансплантата, а местное внутриопухолевое введение антагомии снизилась рост опухоли, измеренная как уменьшение биолюминесценции опухоли16. Поскольку создание надежных моделей мыши, имитирующих прогрессирование опухоли человека, имеет важное значение для разработки уникальных терапевтических подходов, ортотопическая имплантация первичных опухолей человека является более ценной платформой для клинической проверки новых препаратов, чем модели подкожной имплантации. Таким образом, для того, чтобы лучше оценить терапевтический потенциал антагоми, мы использовали ортотопическую модель мыши с системной доставкой в кровоток, получая те же результаты.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается метод для изучения функции in vivo miRNA, чтобы лучше понять его роль в инициировании и прогрессировании опухоли, а также его потенциал в качестве терапевтической цели при раке щитовидной железы. Опухолевые модели ксенотрансплантата здесь описаны основаны на испол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Ракель Ароча Риско за ее помощь в лечении и уходе за мышами. Мы благодарим д-ра Дж. Бланко (Каталонский институт передовой химии-CSIC) и д-ра Э. Мату (Институт Ресерка де л’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Барселона (Испания) за то, что они подарили CMV-Firefly luc- IRES-EGFP и Cal62-Luc.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
- Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. 암 연구학. 65 (9), 3509-3512 (2005).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
- Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
- Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
- Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
- Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
- Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. 암 연구학. 75 (19), 4119-4130 (2015).
- Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
- Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
- Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , (2019).
- Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).
