En Vivo inhibición de MicroRNA para disminuir el crecimiento tumoral en ratones
Summary
Este protocolo describe los modelos de xenoinjerto y ratón ortotópico de la tumorigenesis tiroidea humana como una plataforma para probar los tratamientos inhibidores basados en microARN. Este enfoque es ideal para estudiar la función de los ARN no codificantes y su potencial como nuevas dianas terapéuticas.
Abstract
Los MicroRNAs (miRNAs) son reguladores importantes de la expresión génica a través de su capacidad para desestabilizar el ARNm e inhibir la traducción de arNM objetivo. Un número cada vez mayor de estudios han identificado los miRNAs como biomarcadores potenciales para el diagnóstico y pronóstico del cáncer, y también como dianas terapéuticas, añadiendo una dimensión adicional a la evaluación y el tratamiento del cáncer. En el contexto del cáncer de tiroides, la tumorigenesis se debe no sólo a mutaciones en genes importantes, sino también a la sobreexpresión de muchos miRNAs. En consecuencia, el papel de los miRNA en el control de la expresión del gen tiroideo está evolucionando como un mecanismo importante en el cáncer. En este documento, presentamos un protocolo para examinar los efectos de la administración de inhibidores de miRNA como una modalidad terapéutica en el cáncer de tiroides utilizando xenoinjerto tumoral humano y modelos de ratón ortotópico. Después de diseñar células tumorales tiroideas estables que expresan GFP y luciferasa, las células se inyectan en ratones desnudos para desarrollar tumores, que pueden ser seguidos por bioluminiscencia. La inhibición in vivo de un miRNA puede reducir el crecimiento tumoral y regular las metas del gen del miRNA. Este método se puede utilizar para evaluar la importancia de un miRNA in vivo determinado, además de identificar nuevas dianas terapéuticas.
Introduction
El cáncer de tiroides es una neoplasia maligna endocrina con una incidencia creciente, aunque en términos generales tiene un buen resultado1. Sin embargo, algunos pacientes desarrollan formas agresivas de la enfermedad que son intratables y las bases moleculares no se entienden mal2.
Los miRNAs son ARN no codificantes de 22 nucleótidos que regulan la expresión génica en muchos tejidos, normalmente por unión de pares de bases a la región no traslacional de 3′ (3’UTR) de ARN mensajeros objetivo (RNRa), desencadenando la degradación del ARNm o la represión traslacional 3 , 4. Cada vez hay más pruebas que demuestran que la desregulación de la expresión de microARN es un sello distintivo del cáncer, ya que estas moléculas modulan la señalización proliferativa, la migración, la invasión y la metástasis, y pueden proporcionar resistencia a la apoptosis 5,6. En los últimos años, muchos estudios han identificado los miRNAs como biomarcadorespotenciales para el diagnóstico y pronóstico del cáncer, así como las dianas terapéuticas 7, proporcionando una nueva dimensión a la evaluación y el tratamiento del cáncer.
los miRNAs han tomado el centro del escenario en oncología molecular humana como factores clave de las neoplasias tiroideas humanas8,9,10,11,12. Entre los miRNAs regulados, miR-146b está altamente sobreexpresado en tumores de carcinoma tiroideo papilar (PTC) y se demostró que aumenta significativamente la proliferación celular, y se asocia con agresividad y pronóstico sombrío6, 12 , 13 , 14 , 15. Además, miR-146b regula varios genes tiroideos implicados en la diferenciación12,y también importantes genes supresores de tumores como PTEN16 y DICER117. A pesar de su importancia en la biología del cáncer, la terapia oncológica basada en miRNA todavía está en sus primeras etapas, y muy pocos estudios han abordado el cáncer de tiroides – el más frecuente de los tumores endocrinos18. Aquí describimos un protocolo utilizando dos modelos de ratón diferentes con tumores derivados del ser humano, en el que la administración de un inhibidor de miRNA sintético (antagomiR) que inhibe específicamente un miRNA celular puede bloquear el crecimiento tumoral. Primero utilizamos un modelo de xenoinjerto común, y la administración intratumoral local de un crecimiento tumoral disminuido de antagomiR medido como una reducción en la bioluminiscencia tumoral16. Debido a que el establecimiento de modelos de ratón robustos que imitan la progresión tumoral humana es esencial para desarrollar enfoques terapéuticos únicos, la implantación ortotópica de tumores humanos primarios es una plataforma más valiosa para la validación clínica de nuevos fármacos que modelos de implantación subcutánea. Así, con el fin de evaluar mejor el potencial terapéutico del antagomiR, utilizamos un modelo de ratón ortotópico con parto sistémico en el torrente sanguíneo, obteniendo los mismos resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un método para estudiar la función in vivo de un miRNA con el fin de entender mejor su papel en la iniciación y progresión del tumor, y su potencial como diana terapéutica en el cáncer de tiroides. Los modelos de xenoinjerto tumoral aquí descritos se basan en el uso de células que pueden ser rastreadas por su señal de bioluminiscencia, permitiendo la medición del crecimiento tumoral in vivo bajo la influencia de un tratamiento. Además, describimos el uso de un tratamiento basado en miRN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Raquel Arocha Riesco por su ayuda en el tratamiento y cuidado de ratones. Agradecemos al Dr. J. Blanco (Instituto Catalán de Química Avanzada-CSIC) y al Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (España) por regalar las células CMV-Firefly luc- IRES-EGFP y Cal62-Luc, respectivamente.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
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