Detta protokoll beskriver xenograft och neobladder musmodeller av mänskliga sköldkörteln uppkomst som en plattform för att testa MicroRNA-baserade hämmare behandlingar. Denna metod är idealisk för att studera funktionen hos icke-kodning RNAs och deras potential som nya terapeutiska mål.
MicroRNAs (miRNAs) är viktiga regulatorer av genuttryck genom sin förmåga att destabilisera mRNA och hämma översättningen av Target mRNAs. Ett ständigt ökande antal studier har identifierat miRNAs som potentiella biomarkörer för cancerdiagnostik och prognos, och även som terapeutiska mål, vilket tillför en extra dimension till cancer utvärdering och behandling. I samband med sköldkörtelcancer, uppkomst resultat inte bara från mutationer i viktiga gener, men också från överuttryck av många mirnas. Följaktligen är miRNAs roll i kontrollen av sköldkörteln genuttryck utvecklas som en viktig mekanism i cancer. Häri presenterar vi ett protokoll för att undersöka effekterna av Mirna-inhibitor leverans som en terapeutisk modalitet i sköldkörtelcancer med hjälp av Human tumör xenograft och neobladder musmodeller. Efter Engineering stabil sköldkörtel tumoral celler uttrycker GFP och luciferase, celler injiceras i nakna möss för att utveckla tumörer, som kan följas av bioluminescens. In vivo hämning av en miRNA kan minska tumörtillväxt och upregulate miRNA gen mål. Denna metod kan användas för att bedöma vikten av en bestämd miRNA in vivo, förutom att identifiera nya terapeutiska mål.
Sköldkörtelcancer är en endokrin malignitet med en ökande incidens, även om det i allmänna ordalag har ett bra resultat1. Ändå, vissa patienter utvecklar aggressiva former av sjukdomen som är behandlingsbar och molekylära baser är dåligt förstås2.
miRNAs är 22-nukleotid-lång icke-kodning RNAs som reglerar genuttryck i många vävnader, typiskt med bas-par bindning till 3 ‘ untranslational region (3 ‘ UTR) av Target Messenger RNAs (mRNAs), utlöser mRNA nedbrytning eller translationell repression 3 , 4. det finns allt fler bevis som visar att avregleringen av MicroRNA Expression är ett kännetecken för cancer, eftersom dessa molekyler modulera proliferativ signalering, migration, invasion och metastaser, och kan ge resistens mot apoptos 5,6. Under de senaste åren har många studier identifierat miRNAs som potentiella biomarkörer för cancerdiagnos och prognos samt terapeutiska mål7, vilket ger en ny dimension till cancer utvärdering och behandling.
mirnas har tagit mitt skede i human molekylär onkologi som viktiga drivkrafter för mänsklig sköldkörtel neoplasmer8,9,10,11,12. Bland miRNAs upp-reglerade, miR-146b är mycket överuttrycks i papillär sköldkörtelcancer (PTC) tumörer och visades att avsevärt öka cellproliferation, och att associeras med aggressivitet och dyster prognos6, 12 , 13 , fjorton , 15. Dessutom reglerar Mir-146b flera sköldkörtel gener inblandade i differentiering12, och även viktiga tumör SUPPRESSOR gener såsom PTEN16 och DICER117. Trots sin betydelse i cancerbiologi, miRNA-baserad cancerterapi är fortfarande i ett tidigt skede, och mycket få studier har behandlat sköldkörtelcancer-den mest frekventa av de endokrina tumörer18. Här beskriver vi ett protokoll med hjälp av två olika musmodeller med mänskliga härledda tumörer, där administrationen av en syntetisk miRNA-hämmare (antagomiR) som specifikt hämmar en cellulär miRNA kan blockera tumörtillväxt. Vi använde först en gemensam xenograft modell, och den lokala intratumor administrering av en antagomir minskad tumörtillväxt mätt som en minskning av tumör Mareld16. Eftersom inrättandet av robusta musmodeller imitera människans tumör progression är viktigt att utveckla unika terapeutiska metoder, ortotopisk implantation av primära mänskliga tumörer är en mer värdefull plattform för klinisk validering av nya läkemedel än subkutana implantations modeller. Således, för att bättre kunna bedöma den terapeutiska potentialen av antagomiR, använde vi en ortotopisk musmodell med systemisk leverans i blodet, få samma resultat.
Denna uppsats beskriver en metod för att studera in vivo funktion av en miRNA för att bättre förstå dess roll i tumör initiering och progression, och dess potential som ett terapeutiskt mål i sköldkörtelcancer. Tumören xenograft modeller här beskrivs är baserade på användning av celler som kan spåras av deras Mareld signal, tillåter mätning av tumörtillväxt in vivo under påverkan av en behandling. Dessutom beskriver vi användningen av en miRNA-baserad behandling för sköldkörtelcancer, som för nä…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Raquel Arocha Riesco för hennes hjälp med behandling och skötsel av möss. Vi tackar Dr J. Blanco (katalanska Institutet för Advance kemi-CSIC) och Dr E. Mato (Institut de Reserca de L’ Hospital de La Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Spanien) för Gifting den CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP och Cal62-Luc celler, respektive.
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |