Summary

Kırmızı ışık düzenlemek Candida albicans biyofilm büyüme ile günlük fototerapi

Published: April 23, 2019
doi:

Summary

Burada, Candida albicans biyofilm büyüme üzerine kırmızı ışık uygulama sonucu değerlendirmek için bir protokol mevcut. 635 nm dalga boyu ve enerji yoğunluğu 87.6 J·cm-2 , tutarlı olmayan kırmızı ışık aygıtla Candida albicans biyofilmler 48 h için büyüme boyunca uygulandı.

Abstract

Burada, başına harcırah kırmızı ışık tedavi Candida albicans biyofilm büyüme üzerine sonuçlarını değerlendirmek için bir protokol mevcut. C. albicans SN425 planktonik büyüme artırmak için Maya azot Bankası medyada inoculums büyüdü. Biyofilm oluşumu için amino asit yüksek konsantrasyonda var, RPMI 1640 medya biyofilm büyüme yardımcı olmak için uygulandı. 48 h biyofilmler tutarlı olmayan bir ışık cihazı ile günde 1 dk süreyle tedavi (kırmızı ışık; dalga boyu 635 = nm; enerji yoğunluğu 87.6 J·cm-2=). Olumlu denetim (PC), % 0.12 klorheksidin (CHX) uygulandı ve bir negatif kontrol (NC), %0.89 NaCl biyofilmler için uygulandığı gibi. Birimleri (CFU), oluşturan colony kuru ağırlık, çözünür ve çözünmez exopolysaccharides tedaviler sonra sayısal. Kısaca, burada sunulan iletişim kuralı basit, tekrarlanabilir ve canlılığı, ilgili yanıtlar kırmızı ışık tedavisi. sonra kuru ağırlık ve ekstraselüler polisakkarit tutarları sağlar

Introduction

Diyabet, immünsüpresif tedavi uygulamaları, HIV enfeksiyonu, AIDS salgınının, invaziv klinik yordamlar ve son yıl içinde geniş spektrumlu antibiyotik tüketimi artan insidansı Candida albicans insidansı artmıştır hastalıkları1,2ilgili. C. albicans enfeksiyonları sık biyofilm geliştirilmesi için ilgili ve kandidiyazis veya candidemia1,2gibi sistemik bulgular gibi klinik bulgular neden olabilir. Bir biyofilm büyümenin en önemli virülans faktörlerin ekstraselüler polisakkarit matris olarak tanımlanmıştır. Biyofilm oluşumu için varolan antifungal ilaçlar, çevresel stres ve konak immün mekanizmalar3direncini artırmak için işbirliği yapmaktadır.

C. albicans biyofilm büyüme maya hücreleri substrat yüzey ve hyphal büyüme yoluyla yayılması ve ardından bir substrat erken bağlılığı planktonik hücre ile başlar. Son biyofilm büyüme neyin maya benzeri geliştirme bastırılır, hyphal geliştirme genişletir ve hücre dışı matriks biyofilm4içine alır olgunlaşma aşama aşamadır. C. albicans exopolysaccharides (EPS) matris mannan-glukan karmaşık5,6oluşturmak için etkileşim. Exopolysaccharides etkileşim biyofilmler uyuşturucu7karşı savunma için önemlidir. Bu nedenle, EPS C. albicans hücre dışı matriks gelen azalma oral kandidiyaz denetim için yeni antibiofilm protokolleri gelişimini desteklemek.

Fotodinamik antimikrobiyal kemoterapi (anlaşma) bir antimikrobiyal olarak uygulanmış ve ışık büyüme, gelişme ve çeşitli organizmalar8 davranışını düzenler. ANLAŞMA belirli bir dalga boyu ve bir ışık emici photosensitizer9görünür ışığında uygular. Ancak, dezenfeksiyon biyofilm Penetran zorlukları alt etkinlik10neden vardır. Terapötik ajanlar başarısızlığı tamamen biyofilmler sızmaya biyofilmler geleneksel antimikrobiyal tedavi3,5zaman zaman karşı koymak bir nedenidir. Kapalı mikrobiyal hücreleri devre dışı bırakmak hücre dışı matriks nüfuz antimicrobials gerekir; Yine de, EPS düzeylerini taşıma biyofilm içine isteyen veya matris kendisi ile antimikrobiyal yanıt11etkileyen böyle moleküller için diffusional bir engel karakterize.

ANLAŞMA dezavantajları göz önüne alındığında, ışık tek başına kullanımı değerli bir gelişme olarak ortaya çıkıyor. Tedavi günde iki kez mavi ışık ile önemli ölçüde üretiminde EPS çözünmez Streptococcus mutans çoğunlukla biyofilm inhibe ön veriler saptandı. EPS çözünmez azalma tarafından mavi ışık biyofilm büyüme azalmış. Yine de, kırmızı ışık C. albicans biyofilmler kullanarak fototerapi sonucunu azdır. Bu nedenle, bu soruşturmanın amacı büyüme ve C. albicans biyofilm düzenlenmesi kırmızı ışık kullanarak ne şekilde fototerapi etkiler değerlendirmek için oldu. İki kez günlük tedavi için biz canlılığı, ilgili yanıtları sağlayan bir kolay ve tekrarlanabilir biyofilm modeli sağlamak için bizim laboratuvar ‘s önceki iletişim kuralları9,12 adapte kuru ağırlık ve ekstraselüler polisakkaritler kırmızı ışık tedavisi. sonra tutarları Aynı iletişim kuralını diğer tedaviler test etmek için kullanılabilir.

Protocol

1. Kültür medya hazırlanması Sabouraud dekstroz agar (SDA) hazırlayın. 65 g kloramfenikol (50 mg/L) 1000 ml distile su ile SDA askıya alma. Orta tamamen erimesi için kaynatın. Tarafından 30 dk. serin ile 45-50 ° c 15 PSI (121 ° C), ısıyla sterilize Mix iyi ve SDA 20 mL steril Petri tabak içine dökün (Boyut: 100 x 15 mm). 6,7 g YNB ve 18 g dekstroz 1000 ml ultrasaf su karışımı ile 100 mM glikoz ile desteklenmiş Maya azot temel (YNB) orta hazırlayın. Bir karıştırıcı kullanar…

Representative Results

Şekil 2 görüntüler sonuçları günlük10 C. albicans CFU/mL kırmızı ışık ile başına yolculuğunu tedaviler sonra 1 dk. kırmızı ışık günlük10 CFU/mL NC karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış (p = 0,004). Şekil 3 günlük tedaviler sonra C. albicans biyofilmler biyokütle (mg) sonuçlarını sunar. Tüm gruplar için NC göre biyolojik kütle göst…

Discussion

Başarılı C. albicans biyofilm kültürü için en kritik adımlar şunlardır: 1) öncesi inoculum ve inoculum ile 100 mM glikoz; tamamlanmaktadır YNB orta yapmak 2) 90 dk yapışma aşama için dikkatli bir şekilde iki kez wells %0,89 ile yıkayın için beklemek NaCl hücrelerin; non yapıştırılır kaldırmak için ve 3) RPMI orta RPMI hif büyüme teşvik edecek bu yana biyofilm oluşumu, başlatmak için yapıştırılan hücrelere eklemek için. Aneuploidies C. albicanskültür oluşabilir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada gelişimi için Dr Paula da Silveira, Dr Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr Malvin N. Janal ve Dr. Iriana Zanin teşekkür ederim. Ayrıca Dr Alexander ö. Johnson (UCSF) Bu çalışmada analiz zorlanma bağış için kabul.

Materials

Clorhexidine 20%  Sigma-Aldrich C9394
Dextrose (D-Glucose) Anhydroous Fisher Chemical D16-500
Ethanol 200 proof Decon Laboratories DSP-MD.43
LumaCare LC-122 A  LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA 
NaCl  Fisher Chemical S641-500
NaOH  Fisher Bioreagents  BP 359-500
Phenol 5% Milipore Sigma 843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) Sigma R7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol Acumedia 7306A
Sulfuric acid  Fisher Chemical SA200-1
Yeast nitrogen base  Difco DF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS Sigma-Aldrich M1254
 24-well polystyrene plate  Falcon 353935

References

  1. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
  2. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
  3. Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
  4. Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
  5. Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
  6. Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
  7. Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
  8. Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
  9. de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
  10. Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
  11. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
  12. Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
  13. Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
  14. Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
  15. Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
  16. Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
  17. Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
  18. Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).

Play Video

Cite This Article
Panariello, B. H. D., Garcia, B. A., Duarte, S. Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth. J. Vis. Exp. (146), e59326, doi:10.3791/59326 (2019).

View Video